При диагностике поверхностных микозов не используется. Микробиологическая диагностика микозов микроскопическое исследование

Микроскопия – это один из основных методов в лабораторной диагностике микозов. Проводить это исследование необходимо с того дня, когда на питательной среде появляются первые колонии. Перед микроскопическим исследованием необходимо знать является гриб дрожжевым или плесневым – по внешнему виду колоний, результатам проростковой пробы.

При микроскопии плесневых грибов учитывают структуру мицеллия (т.е. особенности строения гиф, их цвет, септированность; особенности строения конидиев и спор, включая размер, форму, цвет конидиев; строение их клеточной стенки, септированность и т.д.)

Для проведения микроскопии готовят нативные и окрашенные препараты. Для приготовления окрашенных препаратов материал обрабатывают различными способами:

1. Окраска PAS -методом. Использование РAS-метода позволяет выявить нейтральные полисахариды в стенках микроорганизмов. Нейтральные полисахариды – это глюкан-маннановый комплекс, находящийся в клеточной стенке большинства эумицетов, за счет него и происходит окрашивание.

PAS -реакции – один из методов микроскопической диагностики тканевых форм грибковой инфекции. В практических лабораториях для микроскопической диагностики используются различные модификации этого метода: окисление хромовой кислоты – реакция Бауэра; окраска по Гридли.

2. Окраска по методу Грама (модификация по Грам-Вайгерту) для выявления сопутствующих микроорганизмов.

3. Окраска по Циль-Нильсону для выявления кислотоустойчивых микроорганизмов. Если исследуемый материал жидкий , то из него готовят неокрашенный мазок для микроскопии в просветляющих жидкостях: смесь спирта с глицерином в соотношении 1:1.

Следующий этап это микологическое исследование – выделение и идентификация грибов. Рассмотрим особенности этого этапа в зависимости от исследуемого материала.

Микологическое исследование

Культуральное исследование. Культуральное исследование основано на выделение возбудителя из исследуемого материала. Сроки культивирования различны для разных видов грибов (от 2-4 дней до 4 недель), при подозрении на диморфные грибы культуру выделяют до 8 недель. Основными средами для культивирования в микологической лаборатории является среда Сабуро: декстрозный агар Сабуро (плотная среда), бульон Сабуро (жидкая среда). Для подавления роста бактериальной флоры в среду Сабуро добавляют антибиотики (хлорамфеникол, гентамицин, реже стрептомицин, пенициллин). Для подавления роста сапрофитных грибов в среду добавляют циклогексимид, хлорамфеникол. Существуют готовые среды с циклогексимидом (Mycobiotic Mycosel ).

Оптимальным режимом культивирования для большинства патогенных грибов является 30 0 С, 20-25 0 С, реже 37 0 С – при подозрении на диморфные грибы. Длительность инкубации для большинства грибов составляет до 6 недель; если по прошествию этого времени роста не наблюдается, то дают отрицательный ответ. В случае подозрения на диморфный микоз при отсутствии роста в течение 6 недель, культуру выдерживают 8 недель и только после этого дают отрицательный результат.

При культуральном исследовании диагностически значимым являются:

Выделение плесневого или дрожжевого гриба, при исследовании стерильного в норме материала;

Выделение диморфного гриба.

Алгоритм микологического исследования

1. Определение грибковой этиологии возбудителя (микроскопия).

2. Определяют дрожжевой гриб или плесневый:

Микроскопия клинического материала (наличия мицеллия);

Характер колоний на питательной среде, скорость роста (дрожжевые грибы растут 48 часов, плесневые грибы растут медленно).

3. Окончательную идентификацию гриба до уровня вида (внутривидовая) проводят с использованием биохимических тестов и иммунологических методов. При исследовании биохимических свойств изучают способность выделенной культуры к ассимиляции (ауксанограмма) и ферментации (зигограмма). Возможно использование автоматизированных систем идентификации (тест-системы для идентификации грибов).

Критерии этиологической значимости выделения условно-патогенных грибов

1.Если в нативном препарате видны только бластоспоры (сапрофитная вегетация) то это расценивается как носительство.

3.Если бластоспоры единичные и преобладает псевдомицелий, то это признак глубоких органных поражений.

4.Активное почкование бластоспор – свидетельство острого процесса.

5.Количественную оценку результатов – выделение гриба из разведений

10 -фекалии, моча;

10 – мокрота.

6.Повторность высеваемости одного и тогоже вида гриба

7. Наличие антител к выделенному штамму.

Микологическое исследование отделяемого слизистых

1. Подготовка материала. После забора материала со слизистых тампон помещают в 2 мл жидкой среды Сабуро или сусло-агара, или МПБ, разлитого в стерильные пробирки. Их тщательно встряхивают в течение 5 минут, стараясь не замочить пробку. Из полученной взвеси готовят ряд разведений 1:10 и 1:100 и т.д.

Из каждого разведения высевают по 0,1мл на 2 чашки сусло-агара, агара Сабуро или МПА. Посевы на плотных средах и пробирку с жидкой средой с тампоном для обогащения инкубируют при +37 0 С в течение 48 часов:

После пройденного времени посевы просматривают и подсчитывают число колоний и ориентировочно определяют количество дрожжевых колоний. Их количество умножают на 20 и на разведение, из которого сделан высев;

Если на чашках с посевом, сделанным из разведений роста нет, то делают повторный посев из среды обогащения в чашку с сусло-агаром.

Микологическое исследование крови

1. Подготовка материала. После забора крови ее разводят 1:10, для того, чтобы бактерицидные свойства крови не ингибировали рост грибов.

2. Культуральное исследование.

5-10мл крови засевают в 50-100 мл жидкой среды Сабуро с 2% глюкозой. При температуре 37 0 С их инкубируют в течение недели;

Через 5 дней делают контрольный высев. Для этого стерильной пипеткой забирают осадок 3-4 капли из пипетки засевают на сусло-агар и растирают стерильной бактериологической петлей;

Засеянные чашки в течение 2-5 дней держат в термостате при 37 0 С;

Если обнаружен рост, то выдают предварительный ответ о фунгемии, а дальнейшую идентификацию гриба проводят в ходе исследования.

Микологическое исследование биоптатов

1.Для забора материала используют метод отпечатков.

2. Культуральное исследование:

Делают отпечаток исследуемым кусочком ткани на поверхность плотной питательной среды Сабуро;

Этот же кусочек ткани помещают в 50мл жидкой питательной среды (сусло или Сабуро);

Посевы инкубируют при 37 0 С в течение 5 дней.

Первый прием

Лабораторная диагностика

Самыми эффективными методами диагностирования микозов кожи являются различные лабораторные исследования, которые способны выявить возбудителя и помочь в подборе схемы терапии. Для выявления возбудителя микоза назначают такие лабораторные исследования:

• гистологический анализ;
• бактериологический посев;
• иммунологическое исследование;
• ПЦР-диагностирование;
• культуральное обследование;
• микробиологические исследования.

Микробиологическая диагностика является наиболее распространенным и самым простым методом выявления микоза в крови и на коже. Для выявления точного диагноза, следует знать, как правильно собирать материал, который необходим при исследовании. Пораженные волосы следует собирать при помощи пинцета. Если инфицирована кожа, то для микроскопии следует соскоблить с поврежденного участка кожный покров. Весь забранный материал помещают в 30% раствор гидроксида калия, а затем на предметное стекло. Микробиологическая диагностика способна выявить, где именно расположен грибок (внутри или снаружи волоса, кожи) и его размеры.

Чтобы предотвратить ошибочный диагноз микоза, следует правильно и грамотно забирать материал для микробиологического обследования.

В медицине существуют такие методы микробиологической диагностики:

• Микроскопия с применением нативных или неокрашенных препаратов. Для этого материал осветляют с помощью 10-30% растворов гидроксида калия или натрия. Затем обработанный материал кладут на лабораторное стеклышко, куда предварительно накапали немного глицерины. Сверху прикрывают стеклянной пластинкой и проводят анализ.
• Микроскопию окрашенных препаратов проводят несколькими способами, которые идентифицируют бактерии, дифференцируют различные бактерии и выявляют разные грибы.

Бактериологический посев

Бактериологический посев – один из самых эффективных методов для диагностики.

Сбор бактериологического посева на питательную среду является точным способом диагностики микоза. Учитывая внешний вид и характеристики выросшей колонии грибка, дерматолог устанавливает тип возбудителя, вызвавшего микоз. Единственный минус обследования в том, что требуется много времени, чтобы вырастить колонию. В среднем необходимо около 3-х недель, чтобы выяснить штамм возбудителя. В некоторых случаях метод не приносит ожидаемых результатов.

ПЦР-диагностика

Метод ПЦР-диагностирования предполагает выявление возбудителя микоза с применением полимеразной цепной реакции. При обследовании увеличивается чувствительность гибридизации, что повышает содержимое вирусного ДНК в исследуемом материале. Этот метод обследования является новым и требует нескольких анализов от пациента. Считается, что такой вид диагностики достаточно затратный, но дает точные результаты.

Культуральное обследование

Культуральные диагностические мероприятия рекомендуются на финальном этапе постановки диагноза. Метод заключается в получении культуры грибка, которая потом отправляется на обследование с помощью микроскопа. Полученный материал кладут на искусственно созданную питательную среду и выявляют род возбудителя, внешний вид, размеры. После чего показано специальное лечение, которое направлено на борьбу с конкретным видом возбудителя микоза.

По данным ученых, симптомы микоза стоп имеются у 70% населения Земли. При этом заболевании страдают межпальцевые складки и кожа на подошвах. Причиной болезни является грибок, который вначале встречался лишь в ограниченных районах юго-востока Азии и в Африке. Первая мировая война, вызвав массовую миграцию населения и ухудшение санитарных условий, привела к распространению болезни по всему миру.

Что провоцирует микоз стоп

Основной возбудитель болезни - Trichophyton rubrum. Поражение могут вызвать T. mentagrophytes и Epidermophyton floccosum. Значительно реже патогенными микробами могут стать грибки рода Candida и плесневые микроорганизмы.

Наиболее значимые факторы риска заболевания:

• сахарный диабет;
• иммунодефицитное состояние (СПИД);
• плоскостопие;
• атеросклероз периферических артерий;
• варикозная болезнь вен нижних конечностей.

Внешние условия, способствующие развитию инфекции:

• закрытая негигроскопичная обувь;
• травмы стопы (мозоли, потертости);
• занятия спортом.

Симптомы микоза стопы чаще всего бывают у взрослых мужчин. Дети болеют редко.

Симптомы микоза стоп

При развитии заболевания появляется шелушение и сухость кожи, зуд и жжение, особенно в межпальцевых промежутках, появление болезненных трещин под пальцами. Иногда первые симптомы микоза стопы – пузырьки, лопающиеся с образованием эрозий. Часто болезнь протекает в стертой форме, проявляясь лишь небольшим шелушением, напоминающим муку, в складках между пальцами.

Существует 4 клинических формы заболевания.

Межпальцевой, или интертригинозный вариант, - самый частый. Кожа между пальцами краснеет, трескается, поверхностный слой мокнет и шелушится. Эти признаки распространяются на подошву, сопровождаются сильным зудом и жжением. Нередко присоединяется бактериальное воспаление.

Сквамозно-гиперкератотический вариант связан с выраженным утолщением и растрескиванием кожи. Подошва краснеет и шелушится. В области пяток появляются глубокие болезненные трещины, зуд обычно нехарактерен. Часто это двустороннее поражение, его еще называют «мокасиновой стопой».

Дисгидротический вариант сопровождается возникновением множественных мелких зудящих болезненных пузырьков. Они сливаются друг с другом, образуя крупные пузыри. Покрышки пузырей лопаются, обнажая блестящую ранимую болезненную поверхность – эрозию. Внешние проявления напоминают экзему.

Нередко присоединяется микробное воспаление с увеличением паховых лимфоузлов, лихорадкой, болью в ноге, тошнотой, головной болью и другими признаками интоксикации. При дисгидротическом виде часто возникает аллергия на грибки – микотическая экзема. Она сопровождается высыпаниями на участках тела, не зараженных грибком, например, на кистях.

Стертый вариант обычно протекает незаметно. Он сопровождается небольшим шелушением кожи между большим и указательным и/или безымянным и мизинцем на ноге. Зуд отсутствует.

Признаки микоза стоп

Разные виды микоза стоп могут быть самостоятельными заболеваниями или протекать как часть общего грибкового поражения организма. Иногда возникает признак «две стопы – одна кисть» с вовлечением этих органов. Может присоединяться онихомикоз – грибковое разрушение ногтя. Иногда одновременно страдают паховые складки.

Основные симптомы и лечение микоза стопы представлены на фото:

Шелушение кожи

Сухость и растрескивание кожи

Пузырьки и эрозии

Диагностика

Распознать различные виды микоза стоп опытный врач-дерматолог может во время первого осмотра. Однако для подтверждения диагноза необходимо микроскопическое исследование. Для него используют чешуйки из очага поражения, соскребенные с помощью шпателя и обработанные раствором щелочи. Полученный материал рассматривают под микроскопом и обнаруживают возбудителей.

Метод прямой микроскопии быстрый, дешевый и простой в выполнении, но не позволяет определить, какой вид грибка вызвал заболевание. Поэтому проводится посев материала на питательную среду с последующим культуральным исследованием полученного материала. Однако получить культуру грибка после обнаружения его под микроскопом удается лишь в 20 – 6о% случаев.

Виды лечения микоза стоп

Препараты для терапии грибковых заболеваний должен назначить врач-дерматолог. Обычно лечение микоза стопы проводят с помощью наружных средств.

Один из эффективных препаратов при этом заболевании – клотримазол. В нашем магазине вы можете купить его по невысокой стоимости. Лекарственное средство в форме лосьона Клотримазол для ногтей и кожи подавляет размножение грибков в толще рогового слоя эпителия. При поражении межпальцевых складок лосьон наносят ежедневно на чистую сухую кожу стоп в течение недели, при необходимости дольше.

При выраженном ороговении и растрескивании кожи вначале необходимо устранить омертвевшие кожные наложения. Для этого необходимо использование отшелушивающих медикаментов. Например, назначают салициловую мазь, кремы с молочной кислотой или мочевиной. После удаления роговых отложений лосьон применяют 1 – 2 раза в день.

При дисгидротическом варианте на первом этапе нужно уменьшить мокнутие. Для этого используются примочки с танином или борной кислотой. В тяжелых случаях к лечению добавляют глюкокортикоидные средства. Затем применяют лосьон Клотримазол по обычной схеме.

При стертой форме стопы обрабатывают лосьоном 1 раз в день в течение 7 – 10 дней, но длительность курса индивидуальна и определяется врачом.

Системная терапия

При длительном или рецидивирующем микозе стоп может потребоваться прием противогрибковых препаратов внутрь. Они попадают из желудочно-кишечного тракта в кровоток, а затем в кожу, где уничтожают грибки. Используются три основных препарата:

• флуконазол;
• итраконазол;
• тербинафин.

Длительность приема этих средств составляет не менее месяца. Их цена довольно высока. Поэтому предупредить микоз стопы всегда проще и выгоднее, чем его вылечить.

Системные препараты особенно часто назначаются, если грибок поразил не только кожу, но и ногти. В этом случае лекарства накапливаются в отрастающей части ногтевой пластинки, и постепенно отрастает здоровый ноготь. Для улучшения эффекта ноготь могут полностью удалить хирургическим путем, после чего он восстанавливается уже без грибка.

Сочетание удаления ногтя, системной и местной противогрибковой терапии особенно часто бывает необходимо у пожилых пациентов. В этой группе пациентов нередко ногти растут медленно, кровообращение в стопах нарушено, поэтому для достижения эффекта требуется большая доза препаратов и длительный курс лечения.

Лечение народными средствами

Применение только рецептов народной медицины не поможет избавиться от грибка. Однако такое дополнение к обычной терапии сокращает курс лечения и ускоряет выздоровление.

Полезно каждый вечер делать теплые ванночки для ног в течение 10 минут, после чего тщательно промокнуть стопы полотенцем, особенно между пальцами, и нанести лечебный лосьон Клотримазол для ногтей и кожи. Полезные компоненты для ванн, снимающие воспаление и уменьшающие зуд:

• трава чистотела и зверобоя;
• корни лопуха;
• трава полыни;
• листья эвкалипта;
• хвоя пихты;
• свежая гуща от сваренного молотого кофе;
• поваренная соль;
• смесь из натертого хозяйственного мыла, пищевой соды, марганцовки и горчичного порошка.

Пораженные места можно смазывать березовым дегтем или самостоятельно приготовленной мази из 100 граммов сливочного масла в смеси с растертой головкой чеснока. Полезен и прополис, который можно прибинтовывать к больным ногтям.

Полезно делать компрессы из натуральных средств. Сначала их оставляют на 1 – 2 часа, а при хорошей переносимости – на ночь. Используют такие ингредиенты:

• мякоть тыквы;
• измельченные семена черной редьки;
• перечная мята, растертая с солью;
• листья лопуха или рябины, слегка размягченные с помощью скалки.

Эффективно смазывание пораженных мест соками некоторых растений и других натуральных средств:

• спиртовый раствор прополиса;
• луковый или чесночный сок;
• сок чистотела;
• масло чайного дерева.

Профилактика заболевания

Для того чтобы избежать микоза или предотвратить его рецидив, нужна простая, но постоянная профилактика:

• летом носить воздухопроницаемую обувь из натурального материала;
• при посещении бассейнов, бань, общественных душевых надевать индивидуальные резиновые тапочки;
• не надевать чужую обувь, например, в гостях;
• использовать только собственные приборы гигиены – ножницы, пемзу, пилку для ногтей.

Чтобы избежать повторного заражения, стельки и внутреннюю поверхность обуви нужно регулярно обрабатывать дезинфицирующими средствами. Известный народный рецепт – раствор уксусной эссенции, однако он имеет резкий неприятный запах.

Врачи рекомендуют применять препарат Микоспрей, обладающий не только противогрибковым, но и антибактериальным действием. Микоспрей отлично подходит не только для обработки обуви, но и для нанесения на ноги перед посещением общественных мест для защиты стоп.

Приобрести препараты для лечения микоза стопы и для его профилактики жители Москвы и регионов могут в нашем интернет-магазине. Они имеют доказанную эффективность и безопасность. Их использование рекомендуется всем людям, которые не хотят заразиться грибком стопы или быстро избавиться от него.

2. Лабораторное исследование патологического материала

2.1. Микроскопические исследования

Для обнаружения морфологических элементов гриба - дрожжевых клеток, псевдомицелия, мицелия, конидиеносцев, конидий, тканевых форм глубоких микозов - патологический материал исследуют в нативных и окрашенных препаратах.

Жидкий патологический материал просматривают в неокрашенном состоянии в следующих просветляющих жидкостях: смесь спирта с глицерином (этиловый спирт 1 ч., глицерин 2 ч., дистиллированная вода 2 ч.), раствор Люголя (1 г кристаллического йода, 2 г калия йодида, 150 мл воды), а также в воде или физиологическом растворе. Для приготовления нативных препаратов на предметное стекло петлей или пипеткой наносят каплю материала, затем 1-2 капли просветляющей жидкости, накрывают покровным стеклом и микроскопируют при малом увеличении 1:80 (окуляр 10х и объектив 8х), при котором можно видеть скопления дрожжевых клеток, псевдомицелий, мицелий и другие элементы грибов. При большом увеличении 1:400, можно характеризовать отдельные клетки.

Плотный патологический материал (кожные, ногтевые чешуйки) помещают в каплю 10-20% раствора КОН, слегка подогревают над пламенем горелки (для лучшей мацерации) до появления кристалликов щелочи по периферии капли. Затем каплю накрывают покровным стеклом, слегка надавливают на него и микроскопируют, вначале под малым увеличением для нахождения чешуйки, далее при большом увеличении.

В материале из волос мантия из окружающих волос спор (эктотрикс) или внутри волоса (эндотрикс) элементы гриба обычно очень четко видны. Поражения волос, как и размеры спор, специфичны для различных видов дерматофитов. Необходима дифференциальная диагностика между структурами гриба и артефактами. Возможными источниками ложноположительных результатов являются липидные капли, пузырьки воздуха, волокна текстиля и так называемый “мозаичный гриб”. Липидные капли могут быть похожи на дрожжевые клетки – такие находки наиболее часты в плохо просветленном материале. Волокна текстиля обычно лежат отдельно от материала эпидермиса, волос или ногтя. Они крупнее, чем гифы гриба, неравномерной толщины и не содержат септ. “Мозаичный гриб” – это артефакт, полученный в процессе кристаллизации КОН при чрезмерном нагревании препаратов. В отличие от грибов, четких разделений на клетки не определяется.

Важным этапом диагностики грибковых инфекций является приготовление окрашенных препаратов. Любой патологический материал (мазковые препараты, отпечатки органов, центрифугаты и, конечно, гистологические срезы) должны пройти три основных вида обработки: 1) окраска PAS-методом для выявления истинных грибов – эумицетов; 2) окраска по методу Грама или в модификациях по Грам-Вайгерту, по Боголепову, по Браун-Бренна – для выявления сопутствующей бактериальной микробиоты, для выявления актиномицетов и нокардий; 3) окраска по методу Циль-Нильсона или модификация по методу Киньона – для выявления кислотоупорных микроорганизмов, прежде всего, для индикации и дифференцировки с микобактериями туберкулеза, для обнаружения возбудителей проказы, нокардий и спорообразующих дрожжей.

PAS-метод (Шифф-йодная кислота) предполагает выявление в стенках микроорганизмов нейтральных полисахаридов. В стенках большинства эумицетов имеется в той или иной концентрации глюкан-маннановый комплекс, за счет чего и происходит окрашивание.

Прокариоты (бактерии) оказываются РАS–отрицательными, в том числе интересующие миколога актиномицеты и нокардии. Однако при формировании актиномикотических друз образуется так называемый “цемент”, склеивающий вегетирующий актиномикотический мицелий в гранулу, который также дает РАS-положительную окраску. В связи с чем, этот метод применим и при диагностике актиномикоза.

РАS-реакция (и ее модификация) является важнейшим методом диагностики тканевых форм грибковой инфекции. Метод основан на окислении гликолиевых групп углеводов йодной или хромовой кислотой. Йодная кислота окисляет 1,2 и 1,4 гликоли в альдегиды и разъединяет связи между носящими гидроксильные группы углеродными атомами. Альдегидные группы могут быть обнаружены и при помощи альдегидного реактива Шиффа. In situ в стенках гриба происходит интенсивное окрашивание гетерополисахаридного комплекса в пурпурно-красный цвет (методика – см. приложения).

Для подавления окраски окружающих тканей применяется обработка (“контрокраска”) световым зеленым, метаниловым желтым и т.п. В этом случае выявляются только грибные клетки, что весьма полезно на стадии индикации возбудителя в тканях или в мазковых препаратах. В то же время, судить об ответной реакции организма и альтерации тканей на таких препаратах не представляется возможным. Всегда необходимо иметь параллельные препараты, окрашенные РАS-методом с докраской гематоксилином.

На практике применяется не только РАS-метод в классическом варианте, но и его различные модификации: окисление хромовой кислотой (вместо йодной) – это реакция Бауэра, окраска по Гридли, импрегнация метенаминсеребром по методу Гомори-Грокотт. Все они успешно используются для обнаружения тканевых форм грибов, и в основе их лежит один и тот же принцип (техника – см.приложение). Табл.3.

Таблица 3

Тинкториальные свойства тканевых форм грибов

(в патологическом материале, в гистологических срезах)

При предположении диагноза “криптококкоз” целесообразно применять методы специфического выявления капсульного материала Cr.neoformans , содержащего гликозаминогликаны (кислые полисахариды). Для этой цели используется окраска альциановым синим (по методу Моури), основным коричневым (по методу Шубича), окраска муцикармином. Очень полезна тройная окраска: РАS-реакция, затем обработка альциановым синим, затем гематоксилином. В этом случае становится возможной дифференцировка между криптококками и тканевыми формами других грибов, имеющих сходную морфологию.

Описание патологического материала (гистологических препаратов) включает данные о морфологии и размерах тканевых форм грибов, их тинкториальной характеристике, отношении к тканям хозяина, наличии фагоцитоза, определении сопутствующей микробиоты.

2.2. Посев патологического материала и количественный учет клеток при микозах, вызванных дрожжевыми грибами

Получение культур грибов необходимо для их идентификации и определения чувствительности к антифунгальным препаратам.

МОКРОТУ перед исследованием 5-10 мин гомогенизируют встряхиванием со стерильными бусами. Если мокрота содержит много слизи и плохо гомогенизируется, к ней можно добавить 1-2 мл стерильного физиологического раствора. Мокроту микроскопируют в нативных или окрашенных препаратах. Если при микроскопии мокроты с большим увеличением в поле зрения видны элементы гриба, то ее следует сеять в разведениях 1:10, 1:100, 1:1000, если элементы гриба не обнаруживаются, мокроту сеют не разведенную. Разведения готовят в жидкой питательной среде (сусло, Сабуро, 1% пептонная вода) или в стерильном физиологическом растворе. Из каждого разведения посев производят по 0,1 мл с помощью шпателя на 2 чашки сусло-агара, агара Сабуро или МПА с добавлением антибактериальных антибиотиков – пенициллина и стрептомицина, биомицина (100-200 ед./мл среды). Питательную среду предварительно подсушивают в термостате при +37 С, т.к. при наличии конденсата рост колоний может иметь сливной характер. Посевы инкубируют в термостате при + 37 о С в течение 48 ч. Затем при наличии роста однотипных дрожжевых колоний производят их количественный учет. Расчет численности дрожжевых клеток (n) в 1 мл или 1 г исследуемого материала производят по формуле n = авс, где а - среднее число колоний на одной чашке Петри, в = 10 при объеме посевного материала 0,1 мл, с- степень разведения экскрета (10,100,1000).

Пример расчета: на чашках с разведением 1:1000 выросло в среднем 60 колоний, при этом в 1 мл исследуемого экскрета содержится 60 х 10 х 1000=600000 дрожжевых клеток.

БАЛ, ПРОМЫВНАЯ жидкость бронхов, гайморовых полостей, желчь (порции А,В,С), желудочный сок, дуоденальное содержимое, мочу переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 10-15 мин, после чего надосадочную жидкость быстрым движением сливают. Из осадка готовят нативные препараты для микроскопии. Если при микроскопии дрожжевые клетки обнаруживаются в каждом поле зрения, то посев производят в разведениях 1:100 и 1:1000 по 0,1 мл на плотные питательные среды и инкубируют при 37 С 48 ч. Если при микроскопии осадка дрожжевые клетки не обнаруживаются, осадок засевают без разведения. Количество дрожжевой флоры рассчитывают на 1 мл патологического материала.

ФЕКАЛИИ забирают мерной ложкой в количестве 0,2 г, помещают в1,8 мл жидкого сусла и тщательно размешивают стеклянной палочкой. Полученное разведение (1:10) отстаивают 5-10 мин, готовят разведения 1:100, 1:1000 и засевают в объеме 0,1 мл на 2 чашки Петри с агаризованной средой. Учет количества дрожжевой флоры производят на 1 г фекалий.

ЦЕРЕБРОСПИНАЛЬНАЯ жидкость. Характеризуют ее внешний вид (прозрачная или мутная, бесцветная или окрашенная, наличие примеси крови, осадка). Микроскопируют мазки из осадка ликвора после его центрифугирования. Готовят три препарата: нативный - в капле стерильного физиологического раствора: нативный - в капле туши и мазок для окраски РАS-методом, по Граму и альциановым синим по Моури.

Микроскопия цереброспинальной жидкости в нативных и окрашенных препаратах позволяет установить наличие дрожжевых почкующихся клеток и фрагментов мицелия гриба, либо бактерий, вызывающих гнойный менингит (менингококк, пневмококк, гемофильная палочка и др.). В тушевом препарате может быть выявлен капсульный гриб Cryptococcus neoformans. При этом на сером фоне туши видны почкующиеся дрожжевые клетки, окруженные светлым ореолом капсулы. В тушевых препаратах также могут быть дрожжевые формы Candida albicans , не имеющие светлого ореола капсулы вокруг клетки.

Cr. neoformans может быть также обнаружен с помощью окраски альциановым синим (по Моури). Окраска происходит за счет селективного выявления капсульного гетерополисахарида характерного для Cr.neoformans . При обнаружении в окрашенном по Граму препарате бактериальной флоры дальнейшее исследование цереброспинальной жидкости проводят по соответствующим бактериологическим методикам. После микроскопии осадка производят посев жидкости на 3 чашки свежеприготовленных, подсушенных сусло-агара или агара Сабуро, а также на жидкое сусло или жидкую среду Сабуро. На поверхность питательного агара чашек 1 и 2 наносят 2-3 капли осадка жидкости и тщательно втирают шпателем, а на поверхность агара чашки 3 для обнаружения мицелиальных грибов производят посев по 1 капле в трех точках. Оставшуюся жидкость переносят в 5 мл жидкого сусла или агар Сабуро. Посевы инкубируют при двух температурных режимах: чашку 1 - при +37 о С, а чашки 2 и 3 и посев на жидкой среде - при +28 о С - +30 о С. Посевы при температуре +37 о С просматривают на 2 и 5 день, а при 28 - 30 о С - на 4,7,10 день роста. Если на 5 день при температуре +37 о С и на 10 день при температуре 28-30 о С рост не отмечается, производят высев из жидкой питательной среды на чашки с сусло или агаром Сабуро. В случае отсутствия роста дрожжевой флоры результат посева жидкости регистрируют как отрицательный.

ОТДЕЛЯЕМОЕ свищей. Исследование начинают с микроскопии материала в нативных или окрашенных препаратах. Затем производят посев материала на агаровую среду (сусло или Сабуро), для чего на чашку наносят 2-3 капли отделяемого и шпателем распределяют по поверхности агара. Посевы инкубируют в течение 48 ч при +З7 о С.

ОТДЕЛЯЕМОЕ слизистых.

1. Тампон помещают в пробирку с 2 мл жидкой среды (сусло, Среда Сабуро или МПБ) и встряхивают 5-7 мин, не замочив пробку. Готовят разведения 1:10, 1:100 и высевают по 0,1 мл из каждого разведения на две чашки сусло-агара, агара Сабуро или МПА. Посевы на плотных средах и пробирку с жидкой средой с тампоном (для обогащения) инкубируют при температуре +37 С. Через 48 ч подсчитывают число колоний и ориентировочно определяют количество дрожжевых клеток, взятых тампоном. Для этого количество выросших дрожжевых колоний умножают на 20 и на разведение. При отсутствии роста колоний на чашках из взятых разведений производят повторный высев из среды обогащения на одну чашку с сусло-агаром.

2. Посев можно делать, проводя тампоном с вращением по поверхности питательной среды. При этом количество дрожжевых колоний не учитывают, а отмечают только наличие и интенсивность роста: единичные колонии, значительный или сплошной рост, отсутствие роста микробиоты.

КРОВЬ. Пробы венозной крови для получения гемокультуры необходимо разбавлять средой обогащения, по крайней мере, 1:5 для того, чтобы бактерицидные свойства крови не ингибировали рост грибов. Засевают 5-10 мл свежевзятой крови соответственно в 50-100 мл питательной среды (жидкое Сабуро с 2% глюкозы или в среду Китт-Тароцци после ее регенерации). Для посева можно брать кровь с антикоагулянтом (1:10 5% раствора натрия цитрата). Посевы выращивают 10 дней при +37 о С с контрольным высевом на 5 и 10 дни. Стерильной пипеткой берут осадок, 3 капли которого рассевают бактериологической петлей по поверхности сусло-агара в чашки Петри. Засеянные чашки помещают в термостат с температурой +37 о С на 2-5 суток. В случае роста дрожжевой флоры выдают предварительный ответ о наличии гриба в крови, а культуру определяют до рода и вида.

Описан другой метод посева крови на микофлору (H.Rieth). В этом случае посев 5-10 мл крови производят каплями. На поверхность плотной питательной среды в чашке Петри стерильной пипеткой наносят 40-50 капель крови, на расстоянии 0,5 см между каплями. Посев производят на две чашки Петри, инкубируя в одной чашке при температуре +37 о С, а в другой - при комнатной температуре в течение 2-5 дней.

КУСОЧКИ тканей органов. Делают отпечаток исследуемым кусочком ткани на поверхности плотной питательной среды в чашке Петри, затем производят рассев петлей. Этот же кусочек ткани помещают в 50 мл жидкой питательной среды (сусло, среда Сабуро). Посевы инкубируют в термостате при температуре +37 о С в течение 5 дней.

КОЖНЫЕ и ногтевые чешуйки. Посев чешуек производят независимо от результатов микроскопии. Для этого стерильной микологической лопаточкой, увлажненной в конденсате среды, чешуйки переносят в пробирку на скошенный сусло-агар в 2-3 точки, прижимая их к поверхности среды. В зависимости от количества материала, поступившего на исследование, посев делают в 2-3 пробирки. Посевы инкубируют в термостате при температуре 28-37 о С до 5 дней.

Широко применяются методы быстрой идентификации C.albicans . Этот вид способен образовывать ростковые трубки и короткие нити псевдомицелия в течение нескольких часов (2-4 часа при 37 о С) на сыворотке крови, яичном белке, на среде Игла, на 199 среде и т.п. Практически в лабораториях используется сыворотка человека (остатки от серологических реакций), где при 37 о С образуются ростковые трубки, а через 24 часа клубки псевдомицелия. Для вида C.albicans этот феномен характерен в 90% случаев. Реже образуются ростки у C.tropicalis.

2.3. Микроскопическое исследование и посев патологического материала при подозрении микозов, вызванных плесневыми грибами

Патологический материал может исследоваться в нативных и окрашенных препаратах. Предметные и покровные стекла, предназначенные для приготовления микропрепаратов, должны храниться в смеси спирта с эфиром (1:1) во избежание загрязнения микобиотой воздуха. Перед употреблением предметные и покровные стекла стерилизуют над пламенем горелки.

Микроскопия материала

МИКРОСКОПИЯ мокроты. Для приготовления нативных препаратов мокроту переносят в стерильную чашку Петри и рассматривают на черном фоне для обнаружения мелких частиц (комочков). Комочки могут быть гнойные, гнойно-слизистые, гнойно-кровянистые. Размеры комочков варьируют по величине в пределах 0,3-3 мм в диаметре, цвет их может быть серым, желтоватым, зеленоватым. Для приготовления нативных микропрепаратов отдельные комочки переносят препаравальными иглами или бактериологической петлей в каплю спирта с глицерином, либо в каплю 10% раствора КОН. Накрывают покровным стеклом, слабо надавливают препаровальной иглой и микроскопируют при малом (1:80, окуляр 10 х и объектив 8х) и большом (1:400, окуляр 10х и объектив 40х) увеличениях микроскопа.

Препараты из промывных вод, экссудата, а также желчи, мочи, желудочного сока, ликвора готовят из нативного осадка или из осадка, полученного в результате центрифугирования (при 1500 об/мин в течение 5 мин). Осадок петлей или пастеровской пипеткой переносят в каплю 10% раствора КОН на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и рассматривают при малом и большом увеличениях микроскопа.

Для приготовления окрашенных препаратов исследуемые комочки или каплю осадка равномерно распределяют препаравальными иглами или предметным стеклом меньшего размера по поверхности стерильного предметного стекла до получения тонкого мазка. Полученный мазок подсушивают на воздухе, фиксируют метиловым спиртом или смесью Никифорова (равные части 96% этилового спирта и эфира) в течение 3-5 мин, либо троекратным фламбированием над пламенем горелки. Фиксированный мазок окрашивают по Граму, РАS-методом, калькофлюором белым. Окрашенный препарат микроскопируют с использованием иммерсионной системы микроскопа (1:900, окуляр 10х, объектив 90х).

Посев материала

При исследовании любого патологического материала на мицелиальные грибы его засевают на плотную среду Сабуро или сусло с добавлением пенициллина и стрептомицина (100-200 ед./мл среды). Посев производят в двух повторениях, учитывая различные температурные режимы выращивания мицелиальных грибов (+37 о С и +28 о С), всегда в 3 точки в центре чашки. Время инкубации 4-5 суток.

Мокроту (отобранные комочки) переносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой на поверхность среды Сабуро или сусла. Место посева отмечают карандашом с обратной стороны дна чашки Петри. Засеянные чашки Петри помещают в термостат крышкой вверх.

После определенного срока инкубации засеянные чашки просматривают и при обнаружении спороношения определяют культуру гриба. В случае отсутствия спороношения гриб пересевают на дифференциальную среду Чапека для дальнейшей идентификации.

Осадок промывных вод бронхов, гайморовых полостей, экссудата, мочи, желудочного сока (нативный или после центрифугирования) забирают пипеткой и засевают в объеме 0,1 мл. Фекалии разводят 1:10 (1г фекалий и 9 мл жидкости) в жидкой среде Сабуро или жидком стерильном изотоническом растворе хлорида натрия, эмульгируют, отстаивают 10 мин для осаждения крупных частиц, засевают надосадочную жидкость в объеме 0,1 мл. Отделяемое наружного слухового прохода и зева, взятое тампоном, сеют, тщательно проводя каждой стороной тампона по поверхности питательной среды. Можно засевать смывы с тампонов. Для этого тампоны помещают в 10 мл жидкой среды Сабуро или жидкого сусла со стеклянными бусами и эмульгируют 10 мин, засевают 0,1 мл смыва с тампона газоном (по Лещенко В.М., 1973), либо в три точки.

Кожные и ногтевые чешуйки помещают на поверхность питательной среды, тщательно прижимая их.

Осадок цереброспинальной жидкости (центрифугат при 1500 об/мин в течение 5 мин) сеют на две чашки среды по 0,1 мл, а его остаток засевают в среду обогащения (жидкая среда Сабуро или жидкое сусло), разлитую по пробиркам в объеме 5 мл. Засеянные чашки инкубируют как обычно, а пробирки с посевом на среде обогащения - при + 28 С в течение 10 дней.

В случае наличия роста мицелиального гриба на плотных средах культуру его определяют из этого посева, при отсутствии роста на Сабуро-агаре или сусло-агаре гриб изучают со среды обогащения. Для этого культуру гриба пересевают еще раз на дифференциальную плотную среду Чапека и в дальнейшем идентифицируют.

Из кусочка ткани органа (биопсия, аутопсия) делают отпечаток на поверхность плотной среды надрезанной стороной исследуемого кусочка в трех точках. Одновременно кусочки тканей помещают в 50 мл жидкой питательной среды (Сабуро, сусло).

Кровь исследуют при подозрении на фунгемию в двух - трех повторах. Засевают 5 или 10 мл крови, соответственно в 50 или 100 мл жидкой среды Сабуро с 2 % глюкозы. Посевы выращивают при +37 С и +28 С в течение 10 дней. Первый просмотр посевов проводят через 5 дней, второй - через 10 дней. На пятые сутки можно наблюдать рост мицелиального гриба в виде войлочного комочка на дне и поверхностной пленки. Грибницу пересевают на дифференциальную среду Чапека для определения рода и вида гриба. Если на 5 день рост гриба не отмечается, посевы выдерживают до 10 дней и при отсутствии роста результаты исследования регистрируют как отрицательные.

При посеве на три точки рост гриба в двух и трех точках определяется как диагностически значимый, в одной точке - случайный. При необходимости, возможен повторный посев.

Идентификация выделенных культур плесневых грибов

После выделения культуры мицелиальные грибы пересевают на дифференциальную среду Чапека для родового и, по возможности, видового определения.

В практике диагностических лабораторий, как правило, используют культурально-морфологические критерии идентификации: оценивают характер роста культуры гриба на агаровых средах (культуральная диагностика, макроморфология) и микроморфологию гриба.

В затруднительных случаях используют дополнительные методы диагностики (изучение ферментативной активности, температурных особенностей роста некоторых плесневых грибов).

Понятие макроморфологии (культуральные признаки) включает структуру колонии (пушистая, войлочная, бархатистая, паутинистая, шерстистая, клочковатая, мучнистая и др.), поверхность (плоская, складчатая, бугристая, куполообразная, коремиеформная, зональная и др.), пигментацию колонии гриба и субстрата (различные оттенки зеленого, голубого, фиолетового, черного, серого и др.), наличие экссудата на поверхности колонии.

Микроморфологию гриба из культуры изучают по препаратам, которые в зависимости от родовой принадлежности гриба готовят следующим образом: на предметное стекло наносят каплю жидкости для приготовления препаратов (равные части спирта, глицерина и воды); в нее помещают кусочек грибницы, вырезанной микологической лопаточкой из колонии в виде треугольника с захватом центральной и периферической частей, двумя препаровальными иглами расправляют вырезанный кусочек с осторожностью во избежание образования пузырей воздуха. В некоторых случаях (мукор и ризопус) при приготовлении препарата грибницу расправляют на сухом предметном стекле, на нее наносят каплю жидкости и накрывают покровным стеклом. Препараты просматривают под микроскопом при малом и большом увеличениях. Изучают субстратный и воздушный мицелий, отмечают наличие или отсутствие септ (перегородок), обращают внимание на характер спороношения: конидиеносцы с конидиями и спорангии со спорангиеспорами.

Конидиеносцы различны по своему строению: от простых одиночных спороносных гиф до ветвистых древовидных образований. Конидиеносцы располагаются поодиночке либо группами, они заметно отличаются от вегетативных гиф мицелия, бесцветные или окрашенные, приподнимающиеся, прямостоящие, ниспадающие, стелющиеся. Они могут состоять из одной клетки и из большого количества разных по форме и величине клеток, каждая из которых имеет свое наименование. Например, у рода Aspergillus конидиеносец состоит из следующих клеток: ножки, пузыревидного вздутия, стеригм, цепочек конидий. У рода Penicillium конидиеносец имеет форму простых или сложных кисточек, состоящих также из различных клеток: веточек-рами, метул, фиалид, цепочек конидий.

У плесневых грибов Mucor и Rhizopus спороношение в виде спорангиев с эндоспорангиоспорами. Спорангий находится на конце спорангиеносца. Спорангии шаровидной или грушевидной формы, у большинства с особой колонкой, являющейся продолжением спорангиеносца внутрь спорангия. Спорангиеспоры округлые, бесцветные или окрашенные.

Конидии (споры) у плесневых грибов полиморфные (цилиндрические, шаровидные, овальные, эллипсоидные, яйцевидные, грушевидные, булавовидные) одно- и многоклеточные, варьируют по размеру и окраске, одиночные, цепочками или собраны в головки и располагаются гроздьями. Поверхность конидий может быть гладкая, шероховатая, шиповатая, бородавчатая, щетинистая и т.д.

Микроскопическое исследование и посев патологического материала при микозах, вызванных диморфными грибами

При этих микозах необходимо учитывать диморфизм возбудителей.

Патологическим материалом при первично патогенных микотических инфекциях (кокцидиоидоз, гистоплазмоз, паракокцидиоидоз, североамериканский бластомикоз), а также хромомикозе, споротрихозе, и мицетомах могут быть гной, мокрота, соскобы с язвенных поражений на коже и слизистой, цереброспинальная жидкость, кровь, биопсированные кусочки из очагов поражения.

Сложность при определении возбудителей этих микозов заключается в том, что из-за их диморфизма при микроскопии патматериала будут обнаруживаться тканевые формы гриба, чаще всего дрожжевые клетки различной морфологии или сферулы с эндоспорами, совершенно непохожие на элементы этого же гриба, извлеченные из его культуры, выросшей при температуре +28 - +30 о С на обычном агаве Сабуро, со значением рН ближе к кислому. Однако нужно иметь в виду, что у некоторых диморфных грибов, можно получить и в культуре дрожжевую фазу роста гриба, часто напоминающую его тканевую форму, но при выращивании на средах, богатых белками со слабо щелочной реакцией (рН = 7,6 - 7,8), при температуре 37 о С.

Вышеуказанное относится к грибам: Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis и Sporothrix schenckii.

Лабораторная диагностика микозов, вызванных упомянутыми здесь грибами, основана на обнаружении тканевых форм в патологическом материале при микроскопии, выделении культуры возбудителя и его идентификации по культурально-морфологическим признакам.

Микроскопическое исследование производят в неокрашенных препаратах на предметном стекле в капельке 10% растворе едкой щелочи или смеси спирта с глицерином в равных объемах или в окрашенных мазках (Табл.3).

Посев патологического материала производят на вышеуказанные питательные среды в чашках Петри с помощью бактериологического шпателя по общепринятой методике.

2.5. Микроскопическое исследование и посев патологического материала при дерматомикозах (кератомикозах и дерматофитиях).

Объектом исследования являются поверхностные микозы, поражающие только кератиновый слой эпидермиса, и дерматофиты, поражающие кожу и ее придатки (волосы, ногти), возбудителями которых являются грибы, относящиеся к родам Trichophyton, Microsporum и Epidermophyton.

Лабораторное микологическое исследование включает те же этапы, что и при других микозах: микроскопию материала и получение чистой культуры при его посеве. Правильное взятие материала чрезвычайно влияет на успех микроскопии и получение культуры.

Патологический материал исследуют в ближайшие сроки после взятия. Предварительно его делят на три части: для микроскопии, культивирования и повторного изучения. Микроскопия патологического материала - наиболее простой и быстрый метод для установления наличия гриба в тканях. Размельченный материал помещают на середину предметного стекла в каплю 10-20% раствора КОН и слегка подогревают над пламенем спиртовки до получения белесого ободка по краю капли, накрывают покровным стеклом и оставляют на 5-10 мин (волосы, кожные чешуйки) и 30 - 40 мин (ногтевые) для мацерации и просветления; материал можно обработать и без нагревания, для этого препарат оставляют в 20% растворе КОН на 30-60 мин.

Микроскопируют вначале под малым, затем большим увеличением микроскопа.

Культуральное исследование необходимо для выделения и идентификации возбудителя. Засеваемый материал максимально измельчается и засевается в минимальных количествах на скошенный агар в пробирках в 2-3 точки на расстоянии 1-2 см. Материалом одной пробы засевают не менее 2-3 пробирок (волосы) и 4-5 пробирок (кожные и ногтевые чешуйки). Для первичной изоляции дерматофитов лучше всего использовать стандартную агаризированную среду Сабуро с 2-4% глюкозы или сусло-агар, содержащие антибактериальные антибиотики (пенициллин 50 мкг/мл + стрептомицин 50 мкг/мл или биомицин 200 ед./мл) и антиплесневый антибиотик актидион (циклогексимид) 0,1 - 0,5 мг/мл. Актидион не влияет на рост дерматофитов и подавляет многие плесневые грибы, а также виды Candida и Cryptococcus.

Посевы инкубируют при 22-30 о С (лучше всего 28 о С). Появление роста дерматофитов отмечается с 4 по 12 день инкубации в точках посева по краям внесенного материала. При отсутствии роста в течение 30 дней результаты культивирования считаются отрицательными. В оптимальных условиях первичные культуры многих дерматофитов можно идентифицировать на 7-10 день после посева, но следить за посевами нужно в течение 20-30 дней. Первичные культуры растут сравнительно медленно и при использовании сред без антибиотиков дерматофиты могут быть подавлены более быстро растущими бактериями или плесневыми грибами. При появлении роста в первичном посеве необходимо произвести отсев с края колонии на свежую дифференциальную среду для получения чистой культуры, которая будет служить материалом для идентификации выделенного дерматофита.

2.6. Серологические методы диагностики микозов

Значение серологических методов состоит, главным образом, в следующем: выявление больных с вероятными инвазивными микозами; подтверждение микотической природы аллергических заболеваний; скрининговое обследование групп риска развития микозов.

Ложно положительные результаты серологических проб возможны при миконосительстве и у здоровых людей, сенсибилизированных антигенами грибов, отрицательные пробы могут быть при иммунодефиците даже на фоне протекающего инвазивного микоза.

Рутинные общепринятые методы серологической диагностики микозов
достаточно подробно описаны /П.Н.Кашкин, В.В.Лисин. "Практическое
руководство по медицинской микологии", Медицина, 1983/. Однако в последние
десятилетия произошли заметные сдвиги в методических подходах /Елинов Н.П.,
2001/. Предложены оригинальные процедуры обнаружения антигенов и антител
некоторых метаболитов клеток грибов; созданы специальные диагностические
наборы (“киты”), например Pastorex ® Candida, для определения в
реакции "латекс-агглютинации" повторяющихся олигоманнозных эпитопов антигенных
структур/, экспрессирующихся на большом числе макромолекул
гриба; для определения антигена-маннана Candida, например, в
сыворотке крови пациента с кандидемией, можно воспользоваться набором Platelia ® Candida.
С помощью первого набора порог определения антигенных структур равен 2,5 нг/мл, с помощью второго в связке с _____________методом порог определения - 0,5 нг/мл.

Возбудители микозов, наиболее часто выявляемые при лабораторном исследовании различных клинических материалов

Кровь

• Candida
• Cryptococcus
• Мицелиальные возбудители редко выявляются при исследовании крови за исключением Fusarium

Спинномозговая жидкость

• Candida
• Cryptococcus

Гной, отделяемое из абсцессов, язв и пр.

• Candida
• Cryptococcus
• Fusarium
• Aspergillus
• Sporotrix

Респираторные секреты (мокрота, БАЛ, бронхиальная браш-биопсия, транстрахеальный аспират)

• Aspergillus
• Candida
• Cryptococcus
• Mucor
• Scedosporium
• Rhizopus
• Sporotrix

Отделяемое, биопсийный материал из ран

• Aspergillus
• Candida
• Fusarium
• Rhizopus

Прочие биосубстраты

• Candida
• Cryptococcus

Материал из грудной,брюшной полости; синовиальная жидкость

• Aspergillus
• Candida
• Fusarium

Стекловидное тело

• Candida
• Aspergillus

IV. Критерии диагностики системных микозов: клинические и лабораторные параметры окончательного диагноза

Эзофагит

• наличие характерных изменений при эзофагоскопии
• выявление гриба при культивировании биопсийного материала
• наличие псевдомицелия в окрашенных мазках или признаков инвазивного роста грибов в биопсийном материале

Пневмония

Пневмония, обусловленная Candida spp.

• остро возникшие инфильтративные изменения на рентгенограмме легких, совпадающих с клиническими проявлениями грибковой пневмонии
• выявление Candida spp. При культивировании материала из нижних отделов респираторного трата, полученного при трансторакальной биопсии, трансбронхиальной биопсии, открытий биопсии легкого или торокоскопически направленной биопсии
• выявление псевдомицелия в адекватно окрашенном биопсийном материале

Пневмония, обусловленная Aspergillus spp., Fusarium spp., Scedosporium apiospermum

• выявление элементов грибов в тканях и положительная культура
• персестирующие или прогрессирующие инфильтраты в легких, резистентные к антибактериальной терапии
• выявление одного из указанных возбудителей при культивировании мокроты или БАЛ
• клинические признаки пневмонии (кашель, одышка, “плевральные” боли, хрипы, шум трения плевры)
• характерные изменения при рентгенографии или КТ легких:

Субплевральные инфильтративные, узелковые, остроугольные или кавернозные изменения

Симптом “ореола” при КТ легких

Прогрессирование инфильтративных изменений с образованием полостей и появлением симптома “серпа”

• отсутствие других возбудителей при культивировании БАЛ, которые могли бы вызвать представленные изменения легких

Синусит

• клинические и рентгенологические признаки острого синусита
• микроскопические и культуралъные признаки микоза при исследовании аспирата или биопсийного материала

Инфекция мочевыводящих путей

• выявление >1х10 кое/мл при повторных посевах правильно собранной мочи

Фунгемия

• Однократное выявление грибов при посеве крови в период подъема температуры тела > 38 о С

Острый диссеминированный микоз

• Фунгемия в сочетании с культуральными или гистологическими признаками поражения глубоких тканей (включая подкожную клетчатку) или выявление возбудителя из двух в норме стерильных биосубстратов

Эндофтальмит

• офтальмологические признаки эндофтальмита
• выявление возбудителя из глаза, крови или других очагов диссеминации

Абсцесс или остеомиелит

• рентгенографические/КТ/МРТ признаки остеомиелита
• выявление возбудителя в аспирате или биопсийном материале

Менингит

• определение изменений СМЖ, подтверждающих наличие воспаления, и выявление грибов при микроскопии СМЖ
• выявление грибов при посеве СМЖ или определение антигенов Cr.neoformans, Candida и Aspergillus в СМЖ

Хронический диссеминированный (гепатолиенальный) кандидоз

Возможный

• персистирующая или интермиттирующая лихорадка после завершения периода нейтропении в сочетании с характерными признаками поражения печени, селезенки или почек

Доказанный

• вышеуказанное в сочетании с высевом Candida spp. из крови до появления признаков поражения печени, селезенки или почек или с культуральными, гистологическими признаками кандидоза в биопсийном материале из очагов

V. ВОЗБУДИТЕЛИ ГРИБКОВЫХ ИНФЕКЦИЙ

Существуют различные принципы классифицирования грибковых инфекций и их возбудителей. Нам представляется практически наиболее простым и целесообразным разделить патогенные грибы на 5 основных групп:

1. Возбудители поверхностных микозов;

2. Возбудители дерматомикозов;

3. Возбудители подкожных микозов;

4. Возбудители глубоких микозов (первично-патогенные микромицеты, возбудители оппортунистических инфекций).

5. Возбудители псевдомикозов.

* Следует подчеркнуть, что возбудители первых трех групп у иммуносупрессированных пациентов могут быть причиной фунгемии и полиорганных поражений.

Описание возбудителей микозов в последующих разделах мы даем по единой схеме: его наименование по принятой номенклатуре, перечень синонимов, макроскопическую характеристику колоний на питательных средах и микроскопическую характеристику элементов гриба, видимых под микроскопом в нативных препаратах и из колоний. Приводятся также данные о распространении грибов в природе и перечисляются вызываемые ими заболевания.

Клиническая картина грибковых заболеваний кожи весь­ма полиморфна, поэтому во всех случаях диагноз должен быть подтвержден лабораторными методами исследования. Для лабораторной диагностики микозов используют микроскопический, люминесцентный, культуральный, иммунологический (аллергологический и серологический) методы иссле­дования, а также эксперименты на животных.

Лабораторная диагностика микозов складывается из не­скольких этапов. В обычной клинической практике обычно ограничиваются микроскопическим и культуральным иссле­дованием зараженного материала. При необходимости эти методы дополняются иммунологическими, гистологическими исследованиями, заражением экспериментальных животных. При некоторых микозах кожи важную вспомогательную роль в диагностике играет люминесцентный метод.

Взятие патологического материала.

Успех лабораторного исследования микозов во многом зависит от правильного взятия патологического материала. Поскольку грибы способны поражать различные органы че­ловека, при подозрении на микоз необходимо исследовать различный патологический материл. В дерматологической практике чаще всего приходится иметь дело с микозами, при которых исследованию на грибы подлежат кожные чешуйки, волосы, ногти. При подозрении на глубокие и системные микозы может возникнуть необходимость лабораторной диа­гностики на грибы мокроты, промывных вод, мочи, фекалий, гноя, отделяемого слизистых оболочек, крови, кусочков орга­нов и биопсированной ткани.

В очагах поражения на коже, из которых предполагается брать патологический материал, за несколько дней или не­дель необходимо прекратить всякое лечение. Следует иметь в виду, что использование слабых дезинфицирующих раство­ров или даже индифферентных средств может помешать ис­следованию. Непосредственно перед забором патологическо­го материала очаг поражения необходимо обработать 96% спиртом или раствором ксилола. Материал лучше всего брать со свежих, но уже полностью развившихся очагов по­ражения. Кожные чешуйки необходимо соскабливать с пе­риферии очагов, грибы здесь встречаются чаще всего как в виде мицелия, так и спор. Кожные чешуйки снимаются скальпелем, корочки - эпиляционным пинцетом.

У больных микозами волосистой части головы поражен­ные волосы извлекают эпиляционным пинцетом. Для исследования необходимо брать короткие, перекрученные, изогну­тые в виде дуги или запятой, а также длинные, но покрытые чехлом в основании, волосы. При подозрении на фавус необ­ходимо помнить о том, что волосы не обламываются, но ста­новятся тусклыми, безжизненными, седоватыми.

Соскобы с поверхностных очагов пораженных ногтевых пластинок делают скальпелем, утолщенные ногтевые пластинки срезают скальпелем или маникюрными кусачками.

Жидкий патологический материал собирают асептично в стерильную посуду, чешуйки кожи, ногтя и волосы – на листочки простой или мягкой пергаментной бумаги.

Отделяемое со слизистых оболочек для посева берут тампоном из гигроскопической ваты, который затем помеща­ют в сухую стерильную пробирку или пробирку с 2 мл пи­тательной среды (сусло Сабуро). Материал из влагалища получают из заднего свода; с головки полового члена – из области ве­нечной борозды.

Материал из наружного слухового прохода берут петлей или тампоном, который помещают в пробирку.

Поступивший в лабораторию материал исследуют в течение 1 ч после взятия при хранении в условиях комнатной температуры или не более чем через 3 ч при хранении в холодильнике при температуре 4 °С.

Кровь для исследования на грибы берут из локтевой вены в количестве 5 – 10 мл и вносят сразу с колбочку с жидкой питательной средой или равным количеством цитрата натрия.

При необходимости исследования на грибы биопсийного материала его помещают в стерильную чашечку Петри и используют для микроскопии, посевов на питательные среды и приготовления гистологических препаратов.

Микроскопическое исследование.

Микроскопическое исследование патологического мате­риала на грибы производят в нативных и окрашенных препаратах. Для приготовления неокрашенных препаратов полученный материал размельчают при помощи скальпеля или препаровальной иглы и помещают на середину предметного стекла. Для более четкого выявления элементов гриба производят просветление (мацерацию) материала. С этой целью прибегают к помощи различных веществ, чаще всего едкой щелочи (КОН, NaOH), которые растворяют эпидермальные чешуйки, слизь, гной, просветляют пигмент волоса и тем са­мым делают грибы доступными для исследования.

В некоторых лабораториях просветление препаратов для микроскопического исследования проводят 15 - 30% раство­ром КОН, в который добавляют 5 - 10% коммерческих тем­но-синих чернил фирмы Паркер (Parker"sSuperchromeBlue-BlackInk). При этой окраске гифы и споры окрашива­ются в голубой цвет.