Nepoužíva sa pri diagnostike povrchových mykóz. Mikrobiologická diagnostika mykóz mikroskopické vyšetrenie

mikroskopia - ide o jednu z hlavných metód laboratórnej diagnostiky mykóz. Túto štúdiu je potrebné vykonať odo dňa, keď sa na živnom médiu objavia prvé kolónie. Pred mikroskopickým vyšetrením je potrebné vedieť, či ide o kvasinky alebo plesne - podľa vzhľadu kolónií, výsledkov testu semenáčikov.

Pri mikroskopovaní plesňových húb sa berie do úvahy štruktúra mycélia (t. j. štrukturálne znaky hýf, ich farba, septácia; štrukturálne znaky konídií a spór vrátane veľkosti, tvaru, farby konídií; štruktúra ich bunkovej steny , septácia atď.)

Pripravené na mikroskopiu natívny A maľované drogy. Na varenie maľované prípravkoch sa materiál spracováva rôznymi spôsobmi:

1. FarbeniePAS-metóda. Použitie metódy PAS umožňuje detekovať neutrálne polysacharidy v stenách mikroorganizmov. Neutrálne polysacharidy sú komplex glukán-mannán nachádzajúci sa v bunkovej stene väčšiny eumycét, vďaka čomu dochádza k zafarbeniu.

PAS-reakcie- jedna z metód mikroskopickej diagnostiky tkanivových foriem plesňovej infekcie. V praktických laboratóriách pre mikroskopickú diagnostiku sa využívajú rôzne modifikácie tejto metódy: oxidácia kyseliny chrómovej - Bauerova reakcia; Gridleyho škvrna.

2. Gramovo farbenie (Gram-Weigertova modifikácia) na identifikáciu pridružených mikroorganizmov.

3. Farbenie Ziehl-Nielson na detekciu acidorezistentných organizmov. Ak je študovaný materiál kvapalina, potom sa z neho pripraví nezafarbený náter na mikroskopovanie v číriacich kvapalinách: zmes alkoholu a glycerolu v pomere 1:1.

Ďalším krokom je mykologický výskum.– izolácia a identifikácia húb. Zvážte vlastnosti tejto fázy v závislosti od študovaného materiálu.

Mykologický výskum

Kultúrny výskum. Kultúrny výskum je založený na izolácii patogénu z testovaného materiálu. Termíny kultivácie sú rôzne pre rôzne druhy húb (od 2-4 dní do 4 týždňov), pri podozrení na dimorfné huby sa kultúra izoluje až 8 týždňov. Hlavným médiom na kultiváciu v mykologickom laboratóriu je Sabouraudovo médium: Sabouraud dextrózový agar (husté médium), Sabouraud vývar (tekuté médium). Na potlačenie rastu bakteriálnej flóry sa do Sabouraudovho média pridávajú antibiotiká (chloramfenikol, gentamicín, menej často streptomycín, penicilín). Na potlačenie rastu saprofytických húb sa do média pridávajú cykloheximid a chloramfenikol. Existujú hotové médiá s cykloheximidom ( Mykobiotikum Mycosel).

Optimálny kultivačný režim pre väčšinu patogénnych húb je 30 0 C, 20-25 0 C, menej často 37 0 C - pri podozrení na dimorfné huby. Dĺžka inkubácie pre väčšinu húb je až 6 týždňov; ak po tomto čase nie je pozorovaný žiadny rast, uveďte zápornú odpoveď. V prípade podozrenia na dimorfnú mykózu pri absencii rastu do 6 týždňov sa kultúra uchováva 8 týždňov a až potom je výsledok negatívny.

V kultúrnej štúdii diagnosticky významné sú:

Izolácia plesní alebo kvasinkových húb pri skúmaní normálne sterilného materiálu;

Izolácia dimorfnej huby.

Algoritmus mykologického výskumu

1. Stanovenie hubovej etiológie patogénu (mikroskopia).

2. Určite kvasinkovú hubu alebo pleseň:

Mikroskopia klinického materiálu (prítomnosť mycélia);

Povaha kolónií na živnom médiu, rýchlosť rastu (kvasinkové huby rastú 48 hodín, plesne rastú pomaly).

3. Konečná identifikácia huby na úrovni druhu (vnútrošpecifická) sa vykonáva pomocou biochemických testov a imunologických metód. Pri štúdiu biochemických vlastností sa študuje schopnosť izolovanej kultúry asimilácie (auxanogram) a fermentácie (zygogram). Je možné použiť automatizované identifikačné systémy (testovacie systémy na identifikáciu húb).

Kritériá pre etiologický význam izolácie oportúnnych húb

1. Ak sú v natívnom prípravku (saprofytická vegetácia) viditeľné iba blastospóry, potom sa tento považuje za nosič.

3. Ak sú blastospóry jednotlivé a prevláda pseudomycélium, potom je to znakom hlbokého poškodenia orgánov.

4. Aktívne pučanie blastospór je dôkazom akútneho procesu.

5.Kvantitatívne vyhodnotenie výsledkov - izolácia huby z riedení

10 - výkaly, moč;

10 - spúta.

6. Opakovaný výsev rovnakého druhu huby

7. Prítomnosť protilátok proti izolovanému kmeňu.

Mykologické vyšetrenie slizničného výtoku

1. Príprava materiálu. Po odbere materiálu zo slizníc sa tampón vloží do 2 ml Sabouraudovho tekutého média alebo sladinového agaru, prípadne BCH, naleje do sterilných skúmaviek. Dôkladne sa pretrepávajú 5 minút, snažiac sa nenamáčať korok. Z výslednej suspenzie sa pripraví niekoľko riedení 1:10 a 1:100 atď.

Z každého riedenia naočkujte 0,1 ml na 2 šálky mladinového agaru, Sabouraudovho agaru alebo MPA. Inokulácie na pevnom médiu a skúmavke s tekutým médiom s tampónom na obohatenie sa inkubujú pri +37 0 С počas 48 hodín:

Po uplynutí času sa plodiny prezerajú a spočíta sa počet kolónií a približne sa určí počet kolónií kvasiniek. Ich počet sa vynásobí 20 a riedením, z ktorého sa výsev vyrába;

Ak na platniach s inokuláciou vyrobenou z riedení nie je žiadny rast, potom sa vykoná opätovné očkovanie z obohacovacieho média do platne s mladinovým agarom.

Mykologické vyšetrenie krvi

1. Príprava materiálu. Po odbere krvi sa zriedi v pomere 1:10, aby baktericídne vlastnosti krvi nebrzdili rast plesní.

2. Kultúrne štúdium.

5-10 ml krvi sa naočkuje do 50-100 ml Sabouraudovho tekutého média s 2% glukózou. Pri teplote 37 0 C sa inkubujú týždeň;

Po 5 dňoch vykonajte kontrolný výsev. Na tento účel sa sediment odoberie sterilnou pipetou;

Nasadené poháre sa uchovávajú v termostate pri 37 0 C počas 2-5 dní;

Ak sa zistí rast, vydá sa predbežná odpoveď o fungémii a počas štúdie sa vykoná ďalšia identifikácia huby.

Mykologické vyšetrenie bioptických vzoriek

1. Na odber materiálu sa používa metóda odtlačkov.

2. Kultúrne štúdium:

Odtlačok sa vytvorí s kusom skúmaného tkaniva na povrchu hustého Sabouraudova živného média;

Rovnaký kúsok tkaniva sa umiestni do 50 ml tekutého živného média (sladina alebo Sabouraud);

Plodiny sa inkubujú pri 37 °C počas 5 dní.

Prvý príjem

Laboratórna diagnostika

Najúčinnejšou metódou diagnostiky kožných mykóz sú rôzne laboratórne testy, ktoré dokážu identifikovať patogén a pomôcť pri výbere terapeutického režimu. Na identifikáciu pôvodcu mykózy sú predpísané nasledujúce laboratórne testy:

• histologická analýza;
• bakteriologická kultúra;
• imunologický výskum;
• PCR diagnostika;
• kultúrne vyšetrenie;
• mikrobiologický výskum.

Mikrobiologická diagnostika je najbežnejšou a najjednoduchšou metódou na zistenie mykózy v krvi a na koži. Na identifikáciu presnej diagnózy by ste mali vedieť, ako správne zbierať materiál, ktorý je potrebný v štúdii. Postihnuté vlasy treba zbierať pinzetou. Ak je koža infikovaná, potom pre mikroskopiu by sa mala koža zoškrabať z poškodenej oblasti. Všetok odobratý materiál sa umiestni do 30 % roztoku hydroxidu draselného a potom na podložné sklíčko. Mikrobiologická diagnostika dokáže presne identifikovať, kde sa huba nachádza (vo vnútri alebo mimo vlasu, pokožky) a jej veľkosť.

Aby sa predišlo chybnej diagnóze mykózy, je potrebné správne a kompetentne odobrať materiál na mikrobiologické vyšetrenie.

V medicíne existujú také metódy mikrobiologickej diagnostiky:

• Mikroskopia s použitím natívnych alebo nefarbených prípravkov. Na tento účel sa materiál vyčíri 10-30% roztokmi hydroxidu draselného alebo sodného. Potom sa spracovaný materiál umiestni na laboratórne sklo, kde sa predtým nakvapkalo trochu glycerínu. Vrch zakryte sklenenou doskou a vykonajte analýzu.
• Mikroskopia zafarbených prípravkov sa uskutočňuje niekoľkými spôsobmi, ktoré identifikujú baktérie, rozlišujú rôzne baktérie a identifikujú rôzne huby.

Bakteriologická kultúra

Bakteriologická kultúra je jednou z najviac efektívne metódy pre diagnostiku.

Zber bakteriologického výsevu na živnom médiu je presným spôsobom diagnostiky mykózy. Berúc do úvahy vzhľad a charakteristika pestovanej kolónie huby, dermatológ určí typ patogénu, ktorý spôsobil mykózu. Jedinou nevýhodou prieskumu je, že pestovanie kolónie trvá dlho. V priemere trvá zistenie kmeňa patogénu asi 3 týždne. V niektorých prípadoch metóda neprináša očakávané výsledky.

PCR diagnostika

Diagnostická metóda PCR zahŕňa identifikáciu pôvodcu mykózy pomocou polymerázovej reťazovej reakcie. Počas vyšetrenia sa zvyšuje citlivosť hybridizácie, čím sa zvyšuje obsah vírusovej DNA v testovanom materiáli. Táto vyšetrovacia metóda je nová a vyžaduje si od pacienta niekoľko testov. Predpokladá sa, že tento typ diagnostiky je dosť drahý, ale poskytuje presné výsledky.

Kultúrna skúška

V konečnom štádiu diagnózy sa odporúčajú kultúrne diagnostické opatrenia. Metóda spočíva v získaní kultúry huby, ktorá sa následne odošle na vyšetrenie pomocou mikroskopu. Výsledný materiál sa umiestni na umelo vytvorenú živnú pôdu a identifikuje sa typ patogénu, vzhľad, veľkosť. Potom sa ukáže špeciálna liečba, ktorá je zameraná na boj proti špecifickému typu pôvodcu mykózy.

Podľa vedcov má 70 % svetovej populácie príznaky mykózy nôh. S touto chorobou trpia medziprstové záhyby a koža na chodidlách. Príčinou ochorenia je huba, ktorá sa pôvodne vyskytovala len v obmedzených oblastiach juhovýchodnej Ázie a Afriky. najprv Svetová vojna, spôsobujúce masovú migráciu obyvateľstva a zhoršenie hygienických podmienok, viedli k rozšíreniu choroby do celého sveta.

Čo spôsobuje mykózu nôh

Hlavným pôvodcom ochorenia je Trichophyton rubrum. T. mentagrophytes a Epidermophyton floccosum môžu spôsobiť poškodenie. Oveľa menej často sa huby rodu Candida a plesňové mikroorganizmy môžu stať patogénnymi mikróbmi.

Najvýznamnejšie rizikové faktory ochorenia:

• cukrovka;
• stav imunodeficiencie (AIDS);
• ploché nohy;
• ateroskleróza periférnych artérií;
• kŕčové žily dolných končatín.

Vonkajšie podmienky vedúce k rozvoju infekcie:

• uzavretá nehygroskopická obuv;
• poranenia chodidiel (kurie oká, odreniny);
• šport.

Symptómy atletickej nohy sú najčastejšie u dospelých mužov. Deti zriedka ochorejú.

Príznaky atletickej nohy

S rozvojom ochorenia, olupovaním a suchosťou kože, svrbením a pálením najmä v medziprstových priestoroch sa objavujú bolestivé praskliny pod prstami. Niekedy sú prvými príznakmi mykózy nohy bubliny, ktoré prasknú s tvorbou erózií. Choroba často prebieha vo vymazanej forme, ktorá sa prejavuje iba miernym odlupovaním, pripomínajúcim múku, v záhyboch medzi prstami.

Existujú 4 klinické formy ochorenia.

Interdigitálny alebo intertriginózny variant je najbežnejší. Koža medzi prstami sčervená, praská, povrchová vrstva mokvá a šúpe sa. Tieto znaky siahajú až po podrážku, sú sprevádzané silné svrbenie a pálenie. Často spojené s bakteriálnym zápalom.

Skvamózno-hyperkeratotický variant je spojený s výrazným zhrubnutím a praskaním kože. Podrážka je červená a šupinatá. V oblasti päty sa objavujú hlboké bolestivé trhliny, svrbenie je zvyčajne necharakteristické. Často ide o obojstrannú léziu, ktorá sa nazýva aj „mokasínová noha“.

Dyshidrotický variant je sprevádzaný výskytom viacerých malých svrbivých bolestivých pľuzgierov. Vzájomne sa spájajú a vytvárajú veľké bubliny. Kryty pľuzgierov prasknú, čím sa odkryje lesklý, zraniteľný, bolestivý povrch – erózia. Vonkajšie prejavy pripomínajú ekzém.

Často sa mikrobiálny zápal spája so zvýšením inguinálnych lymfatických uzlín, horúčkou, bolesťou nôh, nevoľnosťou, bolesťou hlavy a inými príznakmi intoxikácie. Pri dyshidrotickej forme sa často vyskytuje alergia na huby - mykotický ekzém. Je sprevádzaná vyrážkami na oblastiach tela, ktoré nie sú infikované hubou, napríklad na rukách.

Vymazaná verzia zvyčajne prebieha nepozorovane. Je sprevádzané miernym olupovaním kože medzi palcom a ukazovákom a / alebo prstencom a malíčkami na nohe. Svrbenie chýba.

Známky atletickej nohy

Rôzne typy mykózy chodidiel môžu byť nezávislé ochorenia alebo sa vyskytujú ako súčasť všeobecnej hubovej infekcie tela. Niekedy sa vyskytuje znak "dve nohy - jedna ruka" so zapojením týchto orgánov. Môže sa pripojiť k onychomykóze - plesňovému zničeniu nechtu. Niekedy súčasne trpia inguinálne záhyby.

Hlavné príznaky a liečba mykózy chodidiel sú uvedené na fotografii:

olupovanie kože

Suchosť a praskanie kože

Bubliny a erózia

Diagnostika

Skúsený dermatológ dokáže už pri prvom vyšetrení rozpoznať rôzne druhy mykóz nôh. Na potvrdenie diagnózy je však potrebné mikroskopické vyšetrenie. Na to sa používajú šupiny z lézie, ktoré sa zoškrabú špachtľou a ošetria alkalickým roztokom. Výsledný materiál sa skúma pod mikroskopom a zisťujú sa patogény.

Priama mikroskopia je rýchla, lacná a ľahko sa vykonáva, ale neurčuje, ktorý typ huby spôsobil ochorenie. Preto sa materiál vysieva na živnú pôdu, po ktorej nasleduje kultúrna štúdia získaného materiálu. Získať kultúru huby po jej zistení pod mikroskopom je však možné len v 20–6 % prípadov.

Typy liečby mykózy nôh

Lieky na liečbu plesňových ochorení by mal predpisovať dermatológ. Zvyčajne sa liečba mykózy nohy uskutočňuje pomocou vonkajších prostriedkov.

Jeden z účinné lieky pri tejto chorobe - klotrimazol. V našom obchode si ho môžete kúpiť za nízku cenu. Liek vo forme pleťovej vody Clotrimazol na nechty a pokožku inhibuje reprodukciu húb v hrúbke rohovej vrstvy epitelu. Pri postihnutí medziprstových záhybov sa pleťová voda nanáša denne na čistú suchú pokožku chodidiel týždeň, v prípade potreby aj dlhšie.

Pri silnom zrohovatení a popraskaní pokožky je potrebné najskôr zlikvidovať odumreté kožné ložiská. To si vyžaduje použitie exfoliačných liekov. Predpíšte napríklad salicylovú masť, krémy s kyselinou mliečnou alebo močovinou. Po odstránení zrohovatených usadenín sa pleťová voda nanáša 1-2x denne.

Pri dyshidrotickom variante je v prvom štádiu potrebné znížiť plač. Na tento účel sa používajú pleťové vody s tanínom alebo kyselinou boritou. V závažných prípadoch sa k liečbe pridávajú glukokortikoidné látky. Potom aplikujte Clotrimazol lotion obvyklým spôsobom.

Pri vymazanej forme sa chodidlá ošetrujú pleťovou vodou raz denne počas 7 až 10 dní, ale trvanie kurzu je individuálne a určuje ho lekár.

Systémová terapia

Pri dlhodobej alebo opakujúcej sa mykóze nôh možno budete musieť užívať antimykotiká ústami. Prechádzajú z gastrointestinálneho traktu do krvného obehu a potom do kože, kde ničia plesne. Používajú sa tri hlavné lieky:

• flukonazol;
• itrakonazol;
• terbinafín.

Trvanie čerpania týchto prostriedkov je najmenej mesiac. Ich cena je dosť vysoká. Preto je prevencia mykózy nôh vždy jednoduchšia a výnosnejšia ako jej liečba.

Zvlášť často sa predpisujú systémové lieky, ak huba zasiahla nielen kožu, ale aj nechty. V tomto prípade sa lieky hromadia v rastúcej časti nechtovej platničky a postupne rastie zdravý necht. Na zlepšenie účinku je možné necht chirurgicky úplne odstrániť, po ktorom sa obnoví bez huby.

Kombinácia odstraňovania nechtov, systémovej a lokálnej antimykotickej liečby je obzvlášť často potrebná u starších pacientov. U tejto skupiny pacientov nechty často rastú pomaly, krvný obeh v chodidlách je narušený, takže na dosiahnutie účinku je potrebná veľká dávka liekov a dlhý priebeh liečby.

Liečba ľudovými prostriedkami

Použitie iba receptov tradičná medicína nepomôže zbaviť sa huby. Tento doplnok ku klasickej terapii však skracuje priebeh liečby a urýchľuje rekonvalescenciu.

Užitočné je robiť si každý večer 10 minút teplý kúpeľ nôh, potom nohy dôkladne osušiť uterákom, najmä medzi prstami a natrieť hojivým mliekom Clotrimazol na nechty a pokožku. Užitočné prísady do kúpeľa, ktoré zmierňujú zápal a zmierňujú svrbenie:

• bylina skorocel a ľubovník bodkovaný;
• korene lopúcha;
• tráva palina;
• listy eukalyptu;
• jedľové ihličie;
• čerstvá usadenina z uvarenej mletej kávy;
• soľ;
• zmes strúhaného mydlo na pranie, sóda bikarbóna, manganistan draselný a horčičný prášok.

Postihnuté miesta je možné namazať brezovým dechtom alebo vlastnoručne pripravenou masťou zo 100 gramov masla zmiešaného s roztlačenou hlavičkou cesnaku. Užitočný je aj propolis, ktorý sa dá obviazať boľavé nechty.

Je užitočné vyrábať obklady z prírodných liečiv. Najprv sa nechajú 1 - 2 hodiny as dobrou toleranciou cez noc. Používajú sa tieto zložky:

• tekvicová buničina;
• drvené semená čiernej reďkovky;
• mäta pieporná, mletá soľou;
• listy lopúcha alebo jarabiny, mierne zmäkčené valčekom.

Účinné je mazanie postihnutých oblastí šťavami z niektorých rastlín a inými prírodnými prostriedkami:

• alkoholový roztok propolisu;
• cibuľová alebo cesnaková šťava;
• šťava z celandínu;
• čajovníkový olej.

Prevencia chorôb

Aby ste sa vyhli mykóze alebo predišli jej opakovaniu, potrebujete jednoduchú, ale stálu prevenciu:

• v lete noste priedušnú obuv z prírodného materiálu;
• pri návšteve bazénov, kúpeľov, verejných spŕch noste individuálne gumené papuče;
• nenoste topánky niekoho iného, ​​napríklad na párty;
• používajte iba vlastné hygienické pomôcky – nožnice, pemzu, pilník na nechty.

Aby sa predišlo opätovnej infekcii, vložky do topánok a vnútorný povrch obuvi by sa mali pravidelne ošetrovať dezinfekčnými prostriedkami. Známy ľudový recept- roztok octovej esencie, ale má ostrý nepríjemný zápach.

Lekári odporúčajú užívať Mycospray, ktorý má nielen protiplesňový, ale aj antibakteriálny účinok. Mycospray je skvelý nielen na ošetrenie obuvi, ale aj na aplikáciu na chodidlá pred návštevou verejných miest na ochranu chodidiel.

Obyvatelia Moskvy a regiónov si môžu kúpiť lieky na liečbu mykózy nôh a na jej prevenciu v našom internetovom obchode. Je dokázané, že sú účinné a bezpečné. Ich použitie sa odporúča všetkým ľuďom, ktorí sa nechcú nakaziť plesňou nôh alebo sa jej rýchlo zbaviť.

2. Laboratórne vyšetrenie patologického materiálu

2.1. Mikroskopické štúdie

Na detekciu morfologických prvkov huby - kvasinkové bunky, pseudomycélium, mycélium, konídiofóry, konídie, tkanivové formy hlbokých mykóz - sa vyšetruje patologický materiál v natívnych a farbených preparátoch.

Kvapalný patologický materiál sa vyšetruje v nezafarbenom stave v týchto číriacich kvapalinách: zmes liehu a glycerínu (etylalkohol 1 diel, glycerín 2 diely, destilovaná voda 2 diely), Lugolov roztok (1 g kryštalického jódu, 2 g draselného jodid, 150 ml vody), ako aj vo vode alebo fyziologickom roztoku. Na prípravu natívnych prípravkov sa na podložné sklíčko nanesie slučkou alebo pipetou kvapka materiálu, potom 1-2 kvapky osvetľovacej kvapaliny, prekryje sa krycím sklíčkom a mikroskopuje sa pri malom zväčšení 1:80 (okulár 10x a objektív 8x), na ktorých je možné vidieť zhluky kvasinkových buniek, pseudomycélium, mycélium a ďalšie prvky húb. Pri veľkom zväčšení 1:400 je možné charakterizovať jednotlivé bunky.

Hustý patologický materiál (koža, nechtové šupiny) sa vloží do kvapky 10-20% roztoku KOH, mierne sa zahrieva nad plameňom horáka (kvôli lepšej macerácii), kým sa po obvode kvapky neobjavia alkalické kryštály. Potom sa kvapka prekryje krycím sklíčkom, mierne sa naň pritlačí a podrobí mikroskopii, najprv pri malom zväčšení, aby sa našla vločka, potom pri veľkom zväčšení.

Vo vlasovom materiáli, plášti spór obklopujúcom vlas (ektotrix) alebo vo vnútri vlasu (endotrix), sú hubové prvky zvyčajne veľmi jasne viditeľné. Vlasové lézie, ako sú veľkosti spór, sú špecifické pre rôzne druhy dermatofyty. Vyžaduje sa diferenciálna diagnostika medzi hubovými štruktúrami a artefaktmi. Možnými zdrojmi falošne pozitívnych výsledkov sú lipidové kvapôčky, vzduchové bubliny, textilné vlákna a takzvaná „mozaiková huba“. Lipidové kvapôčky môžu vyzerať ako kvasinkové bunky a takéto nálezy sú najčastejšie v zle vyčírenom materiáli. Textilné vlákna zvyčajne ležia oddelene od materiálu pokožky, vlasov alebo nechtov. Sú väčšie ako hýfy huby, majú nerovnomernú hrúbku a neobsahujú prepážky. „Mozaiková huba“ je artefakt získaný v procese kryštalizácie KOH pri nadmernom zahrievaní prípravkov. Na rozdiel od húb nie sú jasné bunkové delenia definované.

Dôležitým krokom v diagnostike plesňových infekcií je príprava farbených prípravkov. Akýkoľvek patologický materiál (nátery, odtlačky orgánov, centrifúgy a samozrejme histologické rezy) musí prejsť tromi hlavnými typmi spracovania: 1) farbením metódou PAS na identifikáciu pravých húb – eumycét; 2) farbenie podľa Gramovej metódy alebo v modifikáciách podľa Gram-Weigerta, podľa Bogolepova, podľa Brown-Brenna - na identifikáciu pridruženej bakteriálnej mikrobioty, na detekciu aktinomycét a nokardií; 3) farbenie podľa Ziehl-Nielsonovej metódy alebo modifikácia podľa Kignonovej metódy - na detekciu acidorezistentných mikroorganizmov, predovšetkým na indikáciu a diferenciáciu s Mycobacterium tuberculosis, na detekciu pôvodcov lepry, nokardie a spórotvorby kvasnice.

PAS-metóda (Schiff-jódová kyselina) zahŕňa detekciu neutrálnych polysacharidov v stenách mikroorganizmov. V stenách väčšiny eumycét sa nachádza komplex glukán-mannán v rôznych koncentráciách, v dôsledku čoho dochádza k zafarbeniu.

Ukázalo sa, že prokaryoty (baktérie) sú PAS negatívne, vrátane aktinomycét a nokardií, o ktoré má mykológ záujem. Pri tvorbe aktinomykotických drúz však vzniká takzvaný „cement“, ktorý zlepuje vegetatívne aktinomykotické mycélium do granuly, ktorá dáva aj PAS-pozitívnu farbu. V tejto súvislosti je táto metóda použiteľná aj pri diagnostike aktinomykózy.

PAS reakcia (a jej modifikácia) je najdôležitejšou metódou diagnostiky tkanivových foriem mykotických infekcií. Metóda je založená na oxidácii glykolových skupín uhľohydrátov kyselinou jódovou alebo chrómovou. Kyselina jódová oxiduje 1,2 a 1,4 glykoly na aldehydy a štiepi väzby medzi atómami uhlíka s hydroxylovými skupinami. Aldehydové skupiny možno tiež detegovať pomocou aldehydového Schiffovho činidla. In situ, v stenách huby, je heteropolysacharidový komplex intenzívne zafarbený do fialovo-červenej farby (metóda - pozri prílohy).

Na potlačenie zafarbenia okolitých tkanív sa používa ošetrenie („protináter“) svetlozelenou, metanilovou žltou a pod. V tomto prípade sa detegujú iba bunky húb, čo je veľmi užitočné v štádiu indikácie patogénu v tkanivách alebo v prípravkoch náteru. Zároveň nie je možné posúdiť reakciu tela a zmenu tkaniva na takéto prípravky. Vždy je potrebné mať paralelné sklíčka farbené metódou PAS a kontrastne farbené hematoxylínom.

V praxi sa používa nielen klasická verzia metódy PAS, ale aj jej rôzne modifikácie: oxidácia kyselinou chrómovou (namiesto kyseliny jódovej) je Bauerova reakcia, farbenie Gridley, impregnácia metenamínovým striebrom podľa metódy Gomory-Grocott . Všetky sa úspešne používajú na detekciu tkanivových foriem húb a sú založené na rovnakom princípe (technika - pozri prílohu). Tabuľka 3

Tabuľka 3

Tinktoriálne vlastnosti tkanivových foriem húb

(v patologickom materiáli, v histologických rezoch)

Ak sa predpokladá diagnóza kryptokokózy, je vhodné použiť metódy na špecifickú detekciu kapsulárneho materiálu. Cr.neoformans obsahujúce glykozaminoglykány (kyslé polysacharidy). Na tento účel sa používa farbenie alciánovou modrou (podľa metódy Mowry), zásaditou hnedou (podľa metódy Shubich), farbenie mucikarmínom. Veľmi užitočné je trojité farbenie: PAS reakcia, potom ošetrenie alciánovou modrou, potom hematoxylínom. V tomto prípade je možná diferenciácia medzi kryptokokmi a tkanivovými formami iných húb s podobnou morfológiou.

Opis patologického materiálu (histologické preparáty) zahŕňa údaje o morfológii a veľkosti tkanivových foriem húb, ich farbiacich charakteristikách, ich vzťahu k hostiteľským tkanivám, prítomnosti fagocytózy a determinácii sprievodnej mikroflóry.

2.2. Výsev patologického materiálu a kvantitatívne účtovanie buniek v mykózach spôsobených kvasinkovými hubami

Získanie kultúr húb je nevyhnutné na ich identifikáciu a stanovenie citlivosti na antimykotiká.

Spútum sa pred štúdiou homogenizuje 5 až 10 minút trepaním so sterilnými guľôčkami. Ak spútum obsahuje veľa hlienu a je zle homogenizované, možno k nemu pridať 1-2 ml sterilného fyziologického roztoku. Spútum sa mikroskopicky vyšetruje v natívnych alebo zafarbených preparátoch. Ak sú prvky huby viditeľné v zornom poli počas mikroskopie spúta s veľkým zväčšením, mali by sa zasiať v riedeniach 1:10, 1:100, 1:1000, ak sa nezistia prvky huby, spúta sa vysieva neriedené. Riedenie sa pripravuje v tekutom živnom médiu (sladina, Sabouraud, 1 % peptónová voda) alebo v sterilnom fyziologickom roztoku. Z každého riedenia sa 0,1 ml naočkuje špachtľou na 2 šálky mladinového agaru, Sabouraud agaru alebo MPA s prídavkom antibakteriálnych antibiotík - penicilínu a streptomycínu, biomycínu (100-200 jednotiek / ml média). Živná pôda sa predbežne suší v termostate pri +37 C, pretože v prítomnosti kondenzátu môže mať rast kolónií splývavý charakter. Plodiny sa inkubujú 48 hodín v termostate pri + 37 ° C. Potom, ak dôjde k rastu rovnakého typu kolónií kvasiniek, kvantitatívne sa zaznamenajú. Výpočet počtu kvasinkových buniek (n) v 1 ml alebo 1 g testovaného materiálu sa vykonáva podľa vzorca n = abs, kde a je priemerný počet kolónií na jednej Petriho miske, b = 10 s inokuláciou objem 0,1 ml, c je stupeň zriedenia exkrétov (10 100 1000).

Príklad výpočtu: na miskách s riedením 1:1000 vyrástlo v priemere 60 kolónií, pričom 1 ml testovaného výlučku obsahuje 60 x 10 x 1000 = 600 000 kvasinkových buniek.

BAL, PREPLACHOVACIA tekutina priedušiek, čeľustných dutín, žlč (časti A, B, C), žalúdočná šťava, obsah dvanástnika, moč sa prenesú do centrifugačných skúmaviek a odstredia sa 10-15 minút, potom sa supernatant rýchlym pohybom vypustí . Zo sedimentu sa pripravujú natívne prípravky na mikroskopiu. Ak sa pri mikroskopii zistia kvasinkové bunky v každom zornom poli, potom sa uskutoční očkovanie v riedeniach 1:100 a 1:1000, každé po 0,1 ml, na pevné živné médium a inkubuje sa pri teplote 37 °C počas 48 hodín. sa nezistia pri mikroskopii sedimentu, sediment zasiaty bez chovu. Množstvo kvasinkovej flóry sa vypočíta na 1 ml patologického materiálu.

VÝKALY sa odoberajú odmernou lyžicou v množstve 0,2 g, vložia sa do 1,8 ml tekutej mladiny a dôkladne sa premiešajú sklenenou tyčinkou. Výsledné riedenie (1:10) sa nechá stáť 5-10 minút, pripravia sa riedenia 1:100, 1:1000 a naočkujú sa v objeme 0,1 ml na 2 Petriho misky s agarovým médiom. Započítavanie množstva kvasinkovej flóry produkovanej na 1 g výkalov.

mozgomiešna tekutina. Charakterizujte jeho vzhľad (priehľadný alebo zakalený, bezfarebný alebo farebný, prítomnosť krvných nečistôt, sediment). Mikroskopické nátery zo sedimentu CSF po centrifugácii. Pripravia sa tri prípravky: natívny - v kvapke sterilného fyziologického roztoku: natívny - v kvapke atramentu a náter na farbenie metódou PAS, podľa Grama a alciánová modrá podľa Mowryho.

Mikroskopia cerebrospinálny mok v natívnych a farbených preparátoch umožňuje zistiť prítomnosť pučiacich buniek kvasiniek a fragmentov mycélia huby, prípadne baktérií, ktoré spôsobujú hnisavú meningitídu (meningokok, pneumokok, Haemophilus influenzae a pod.). V prípravku jatočného tela možno zistiť kapsulárnu hubu Cryptococcus neoformans. Súčasne sú na sivom pozadí jatočného tela viditeľné pučiace kvasinkové bunky obklopené svetlou aureolou puzdra. Atramentové prípravky môžu tiež obsahovať kvasinkové formy candida albicans kapsuly bez svetelného halo okolo bunky.

cr. neoformans možno zistiť aj farbením alciánovou modrou (podľa Mowryho). K farbeniu dochádza v dôsledku selektívnej detekcie kapsulárneho heteropolysacharidu charakteristického pre Cr.neoformans. Ak sa v prípravku zafarbenom podľa Grama zistí bakteriálna flóra, vykoná sa ďalšie vyšetrenie cerebrospinálnej tekutiny podľa príslušných bakteriologických metód. Po mikroskopii sedimentu sa kvapalina naočkuje na 3 šálky čerstvo pripraveného, ​​vysušeného mladinového agaru alebo Sabouraudovho agaru, ako aj na tekuté sladinové alebo Sabouraudovo tekuté médium. 2-3 kvapky tekutého sedimentu sa nanesú na povrch živného agaru z platní 1 a 2 a opatrne sa rozotrie špachtľou a 1 kvapka sa naočkuje na povrch agaru z platne 3 na detekciu vláknitých húb. Zvyšná kvapalina sa prenesie do 5 ml tekutej mladiny alebo Sabouraud agaru. Plodiny sa inkubujú pri dvoch teplotných podmienkach: šálka 1 - pri +37 o C a šálka 2 a 3 a výsev na tekuté médium - pri +28 o C - +30 o C. Plodiny pri teplote +37 o C sú pri pohľade na 2. a 5. deň a na 28 - 30 ° C - na 4., 7., 10. deň rastu. Ak sa nezaznamená žiadny rast na 5. deň pri teplote +37 °C a na 10. deň pri teplote 28 – 30 °C, očkovanie sa uskutoční z tekutého živného média na platniach s mladinou alebo Sabouraudovým agarom. Pri absencii rastu kvasinkovej flóry sa výsledok kultivácie kvapaliny zaznamená ako negatívny.

VYPÚŠŤACIE FISTULY. Štúdia začína mikroskopiou materiálu v natívnych alebo zafarbených prípravkoch. Potom sa materiál naočkuje na agarové médium (sladina alebo Sabouraud), pričom sa na misku nanesú 2-3 kvapky výtoku a pomocou špachtle sa rozotrie po povrchu agaru. Inokulácie sa inkubujú 48 hodín pri +37 °C.

VYPÚŠŤAteľná sliznica.

1. Tampón sa vloží do skúmavky s 2 ml tekutého média (sladina, Sabouraudovo médium alebo MPB) a pretrepáva sa 5-7 minút bez namáčania zátky. Pripravia sa riedenia 1:10, 1:100 a 0,1 ml každého riedenia sa naočkuje na dve platne s mladinovým agarom, Sabouraudovým agarom alebo MPA. Inokulácie na pevnom médiu a skúmavka s tekutým médiom s tampónom (na obohatenie) sa inkubujú pri teplote +37 C. Po 48 hodinách sa spočíta počet kolónií a počet buniek kvasiniek odobratých tampónom približne určené. Na tento účel sa počet vyrastených kolónií kvasiniek vynásobí 20 a zriedi sa. V neprítomnosti rastu kolónií na platniach odobratých z riedení sa uskutoční opätovné naočkovanie z obohacovacieho média na jednu platňu s mladinovým agarom.

2. Výsev je možné vykonať tampónom s rotáciou po povrchu živnej pôdy. Zároveň sa neberie do úvahy počet kolónií kvasiniek, ale zaznamená sa iba prítomnosť a intenzita rastu: jednotlivé kolónie, významný alebo nepretržitý rast, nedostatok rastu mikrobioty.

KRV. Vzorky venóznej krvi na hemokultúru musia byť zriedené obohacovacím médiom aspoň 1:5, aby baktericídne vlastnosti krvi nebrzdili rast húb. Vysievajte 5-10 ml čerstvej krvi, resp. do 50-100 ml živného média (tekuté Sabouraud s 2% glukózou alebo Kitt-Tarozziho médium po jej regenerácii). Na siatie môžete odobrať krv s antikoagulantom (1:10 5% roztok citranu sodného). Plodiny sa pestujú 10 dní pri +37 °C s kontrolným výsevom v dňoch 5 a 10. Sterilnou pipetou sa odoberie sediment, z ktorého sa 3 kvapky zasiajú bakteriologickou slučkou na povrch mladinového agaru do Petriho misiek. Nasadené poháre sa umiestnia do termostatu s teplotou +37 ° C na 2-5 dní. V prípade rastu kvasinkovej flóry sa dáva predbežná odpoveď o prítomnosti huby v krvi a kultúra sa určuje podľa rodu a druhu.

Bola opísaná ďalšia metóda hemokultúry pre mykoflóru (H.Rieth). V tomto prípade sa očkovanie 5-10 ml krvi uskutočňuje po kvapkách. Na povrch hustého živného média v Petriho miske sa nanesie sterilnou pipetou 40-50 kvapiek krvi vo vzdialenosti 0,5 cm medzi kvapkami. Výsev sa vykonáva na dve Petriho misky, pričom v jednej miske sa inkubuje pri teplote +37 o C a v druhej pri izbovej teplote 2-5 dní.

KUSY orgánových tkanív. Skúmaným kúskom tkaniva sa urobí odtlačok na povrchu hustého živného média v Petriho miske, potom sa preoseje slučka. Rovnaký kúsok tkaniva sa vloží do 50 ml tekutého živného média (sladina, Sabouraudovo médium). Plodiny sa inkubujú v termostate pri teplote +37 asi C počas 5 dní.

Šupinky KOŽE a nechtov. Výsevné váhy vyrobené bez ohľadu na výsledky mikroskopie. Na tento účel sa pomocou sterilnej mykologickej špachtle navlhčenej v kondenzáte média šupiny prenesú do skúmavky na skosený mladinový agar v 2-3 bodoch a pritlačia sa na povrch média. V závislosti od množstva materiálu prijatého na štúdiu sa výsev vykonáva v 2-3 skúmavkách. Plodiny sa inkubujú v termostate pri teplote 28-37 C asi 5 dní.

Metódy rýchlej identifikácie sú široko používané C.albicans. Tento druh je schopný vytvárať zárodočné trubičky a krátke vlákna pseudomycélia v priebehu niekoľkých hodín (2-4 hodiny pri 37°C) na krvnom sére, vaječnom bielku, na Eaglovom médiu, na médiu 199 atď. V praxi sa v laboratóriách používa ľudské sérum (pozostatky zo sérologických reakcií), kde sa pri 37 °C vytvoria zárodočné trubičky a po 24 hodinách pseudomyceliálne klbká. Pre druh C.albicans tento jav je typický v 90% prípadov. Zriedkavo sa tvoria klíčky C. tropicalis.

2.3. Mikroskopické vyšetrenie a výsev patologického materiálu pri podozrení na mykózy spôsobené plesňami

Patologický materiál možno skúmať v natívnych a farbených preparátoch. Sklíčka a krycie sklíčka určené na prípravu mikropreparátov by sa mali skladovať v zmesi alkoholu a éteru (1:1), aby sa zabránilo kontaminácii vzduchu mykobiotou. Pred použitím sa sklíčka a krycie sklíčka sterilizujú nad plameňom horáka.

Materiálová mikroskopia

mikroskopia spúta. Na prípravu natívnych prípravkov sa spútum prenesie do sterilnej Petriho misky a skúma sa na čiernom pozadí, aby sa zistili malé častice (hrudky). Hrudky môžu byť hnisavé, hnisavé-slizovité, hnisavé-krvavé. Veľkosť hrudiek sa líši vo veľkosti v priemere 0,3-3 mm, ich farba môže byť sivá, žltkastá, zelenkastá. Na prípravu natívnych mikropreparátov sa jednotlivé hrudky prenesú pitevnými ihlami alebo bakteriologickou slučkou do kvapky liehu s glycerínom, prípadne do kvapky 10% roztoku KOH. Prikryte krycím sklíčkom, zľahka stlačte pitevnou ihlou a mikroskopom pri malom (1:80, 10x okulár a 8x objektív) a vysokom (1:400, 10x okulár a 40x objektív) zväčšení mikroskopu.

Prípravky z výplachov, exsudátu, ako aj žlče, moču, žalúdočnej šťavy, mozgovomiechového moku sa pripravujú z natívneho sedimentu alebo zo sedimentu získaného centrifugáciou (pri 1500 otáčkach za minútu počas 5 minút). Precipitát sa prenesie slučkou alebo Pasteurovou pipetou do kvapky 10% roztoku KOH na podložnom sklíčku, prikryje sa krycím sklíčkom a skúma sa pri malom a veľkom zväčšení mikroskopu.

Na prípravu zafarbených prípravkov sa študované hrudky alebo kvapka sedimentu rovnomerne rozložia pitevnými ihlami alebo menším skleneným podložným sklíčkom po povrchu sterilného podložného sklíčka, kým sa nezíska tenký náter. Výsledný náter sa suší na vzduchu, fixuje sa metylalkoholom alebo zmesou Nikiforov (rovnaké diely 96% etylalkoholu a éteru) počas 3-5 minút alebo trojnásobným plameňom nad plameňom horáka. Fixovaný náter je zafarbený metódou Gram, PAS, bielym kalcofluorom. Zafarbený prípravok sa mikroskopuje pomocou systému ponorného mikroskopu (1:900, okulár 10x, objektív 90x).

Výsevný materiál

Pri skúmaní akéhokoľvek patologického materiálu na vláknité huby sa tento naočkuje na husté Sabouraudovo médium alebo sladinu s prídavkom penicilínu a streptomycínu (100-200 jednotiek/ml média). Výsev sa vykonáva v dvoch opakovaniach, berúc do úvahy rôzne teplotné podmienky pre pestovanie vláknitých húb (+37 °C a +28 °C), vždy na 3 body v strede misky. Inkubačná doba je 4-5 dní.

Spútum (vybrané hrudky) sa prenesie bakteriologickou slučkou alebo Pasteurovou pipetou na povrch Sabouraudovej pôdy alebo sladiny. Miesto očkovania je označené ceruzkou na zadnej strane dna Petriho misky. Nasadené Petriho misky sa vložia do termostatu s vekom nahor.

Po určitej dobe inkubácie sa skúmajú nasadené misky a ak sa zistí sporulácia, určí sa kultúra huby. V neprítomnosti sporulácie sa huba subkultivuje na Czapekovom diferenciálnom médiu na ďalšiu identifikáciu.

Sediment bronchiálnych výplachov, čeľustných dutín, exsudátu, moču, žalúdočnej šťavy (natívnej alebo po centrifugácii) sa odoberie pipetou a naočkuje sa v objeme 0,1 ml. Výkaly sa zriedia v pomere 1:10 (1 g výkalov a 9 ml tekutiny) v tekutom Sabouraudovom médiu alebo tekutom sterilnom izotonickom roztoku chloridu sodného, ​​emulgujú sa, usadzujú sa 10 minút, aby sa vyzrážali veľké častice, naočkujú sa supernatantom v objeme 0,1 ml . Odnímateľný vonkajší zvukovod a hltan, odobraté tampónom, sa vysijú, pričom každá strana tampónu sa opatrne potiahne po povrchu živnej pôdy. Môžete naočkovať tampóny. Za týmto účelom sa tampóny vložia do 10 ml Sabouraudovho tekutého média alebo tekutej mladiny so sklenenými guľôčkami a emulgujú sa 10 minút, 0,1 ml výplachu tampónu sa naočkuje trávnikom (podľa Leshchenko V.M., 1973) alebo v troch bodoch.

Šupiny kože a nechtov sa umiestnia na povrch živného média a opatrne ich pritlačia.

Zrazenina mozgovomiechového moku (odstreďovanie pri 1500 otáčkach za minútu počas 5 minút) sa naočkuje do dvoch pohárov média, každý po 0,1 ml, a jeho zvyšok sa naočkuje do obohacovacieho média (kvapalné Sabouraudovo médium alebo tekutá sladina), naleje sa do skúmaviek v objem 5 ml. Naočkované poháre sa inkubujú ako obvykle a skúmavky s naočkovaním na obohacovacie médium sa inkubujú pri + 28 °C počas 10 dní.

V prípade rastu mycéliovej huby na pevnom médiu sa jej kultúra určuje z tohto očkovania, v prípade neprítomnosti rastu na Sabouraudovom agare alebo mladinovom agare sa huba študuje z obohacovacieho média. Na tento účel sa kultúra huby opäť subkultivuje na Czapekovom diferenčne hustom médiu a ďalej sa identifikuje.

Z kúska orgánového tkaniva (biopsia, pitva) sa na povrchu hustého média vytvorí odtlačok s narezanou stranou skúmaného kúska v troch bodoch. Súčasne sa kúsky tkaniva umiestnia do 50 ml tekutého živného média (Saburo, mladina).

Krv sa vyšetruje na podozrenie na fungémiu v dvoch až troch opakovaniach. Naočkujte 5 alebo 10 ml krvi v 50 alebo 100 ml Sabouraudovej tekutej pôdy s 2 % glukózou. Plodiny sa pestujú pri teplote +37 °C a +28 °C počas 10 dní. Prvé prezeranie plodín sa vykonáva po 5 dňoch, druhé po 10 dňoch. Piaty deň je možné pozorovať rast mycéliovej huby vo forme plstenej hrudky na dne a povrchového filmu. Mycélium sa znovu nasadí na Czapekovo diferenciálne médium, aby sa určil rod a druh huby. Ak sa na 5. deň nezaznamená rast huby, plodiny sa uchovávajú až 10 dní a pri absencii rastu sa výsledky štúdie zaznamenajú ako negatívne.

Pri výseve na troch bodoch je rast huby v dvoch a troch bodoch stanovený ako diagnosticky významný, v jednom bode - náhodný. V prípade potreby je možný opätovný výsev.

Identifikácia izolovaných kultúr plesňových húb

Po izolácii kultúry sa vláknité huby subkultivujú na Czapekovom diferenciálnom médiu na generickú a podľa možnosti druhovú identifikáciu.

V praxi diagnostických laboratórií sa spravidla používajú kultúrne a morfologické identifikačné kritériá: posudzuje sa charakter rastu hubovej kultúry na agarovom médiu (kultúrna diagnostika, makromorfológia) a mikromorfológia huby.

V zložitých prípadoch sa používajú ďalšie diagnostické metódy (štúdium enzymatickej aktivity, teplotné charakteristiky rastu niektorých plesňových húb).

Pojem makromorfológia (kultúrne črty) zahŕňa štruktúru kolónie (chlpaté, plstnaté, zamatové, pavučinové, vlnité, rozstrapkané, múčne atď.), povrch (plochý, skladaný, hrboľatý, kupolovitý, jadrovitý, zonálny atď.). .), pigmentácia kolónie huby a substrátu (rôzne odtiene zelenej, modrej, fialovej, čiernej, šedej atď.), prítomnosť exsudátu na povrchu kolónie.

Mikromorfológia huby z kultúry sa študuje podľa prípravkov, ktoré sa v závislosti od generickej príslušnosti huby pripravujú nasledovne: aplikuje sa kvapka tekutiny na prípravu prípravkov (rovnaké diely alkoholu, glycerínu a vody). na podložné sklo; vloží sa do nej kúsok mycélia, vyreže sa mykologickou špachtľou z kolónie vo forme trojuholníka so zachytením centrálnej a okrajovej časti, odrezaný kúsok sa narovná dvoma pitvacími ihlami opatrne, aby sa zabránilo vzniku vzduchové bubliny. V niektorých prípadoch (mukor a rhizopus) sa pri príprave prípravku mycélium rozotrie na suché sklíčko, nanesie sa naň kvapka tekutiny a prikryje sa krycím sklíčkom. Preparáty sa prezerajú pod mikroskopom pri malom a veľkom zväčšení. Študujú substrát a vzdušné mycélium, všímajú si prítomnosť alebo neprítomnosť septa (prepážok), venujú pozornosť povahe sporulácie: konídiofóry s konídiami a sporangiá so sporangiospórami.

Konidiofory sa líšia svojou štruktúrou: od jednoduchých jednoduchých hýf nesúcich výtrusy až po rozvetvené stromovité útvary. Konidiofory sú umiestnené jednotlivo alebo v skupinách, výrazne sa líšia od vegetatívnych hýf mycélia, bezfarebné alebo farebné, vzostupné, vzpriamené, zostupné, plazivé. Môžu pozostávať z jednej bunky a z veľkého počtu buniek rôznych tvarov a veľkostí, z ktorých každá má svoj vlastný názov. Napríklad u rodu Aspergillus tvoria konídiofor tieto bunky: stopka, vezikulárny opuch, sterigmata, reťazce konídií. V rode Penicillium má konídiofor formu jednoduchých alebo zložitých kefiek, ktoré tiež pozostávajú z rôznych buniek: vetvičky rami, metulae, fialidy, reťazce konídií.

Plesne Mucor a Rhizopus majú sporuláciu vo forme sporangií s endosporangiospórami. Výtrusnica je na konci sporangioforu. Výtrusnice sú guľovitého alebo hruškovitého tvaru, väčšinou so špeciálnym stĺpcom, ktorý je pokračovaním sporangiofóru vo vnútri výtrusnice. Sporangiospóry sú okrúhle, bezfarebné alebo farebné.

Konídie (spóry) v plesniach sú polymorfné (valcovité, guľovité, oválne, elipsoidné, vajcovité, hruškovité, kyjovité), jednobunkové a mnohobunkové, líšia sa veľkosťou a farbou, jednotlivé, v reťaziach alebo zhromaždené v hlavičkách a usporiadané do zhlukov . Povrch konídií môže byť hladký, drsný, ostnatý, bradavičnatý, štetinovitý atď.

Mikroskopické vyšetrenie a výsev patologického materiálu pri mykózach spôsobených dimorfnými hubami

Pri týchto mykózach je potrebné počítať s dimorfizmom patogénov.

Patologickým materiálom pri primárnych patogénnych mykotických infekciách (kokcidioidóza, histoplazmóza, parakokcidioidomykóza, severoamerická blastomykóza), ako aj chromomykóza, sporotrichóza a mycetómy môžu byť hnis, spútum, škrabance z ulceróznych lézií na koži a slizniciach, krv, cerebrospinálny mok, biopsie kusov z porážky ohnísk.

Náročnosť určenia pôvodcov týchto mykóz spočíva v tom, že vzhľadom na ich dimorfizmus mikroskopia patologického materiálu odhalí tkanivové formy húb, najčastejšie kvasinkové bunky rôznych morfológií alebo sféruly s endospórami, úplne odlišné od tzv. prvky tej istej huby, extrahované z jej kultúry pestovanej pri teplote +28 - +30 ° C na bežnej agáve Sabouraud, s hodnotou pH bližšou kyslej. Treba si však uvedomiť, že u niektorých dimorfných húb je možné získať kvasinkovú rastovú fázu huby v kultúre, často pripomínajúcu jej tkanivovú formu, ale pri pestovaní na médiu bohatom na bielkoviny so slabo alkalickou reakciou (pH = 7,6 - 7,8 ), pri teplote 37 °C.

Vyššie uvedené platí pre huby: Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis A Sporothrix schenckii.

Laboratórna diagnostika mykóz spôsobených tu uvedenými hubami je založená na detekcii tkanivových foriem v patologickom materiáli počas mikroskopie, izolácii kultúry patogénu a jej identifikácii podľa kultúrnych a morfologických znakov.

Mikroskopické vyšetrenie sa vykonáva v nefarbených prípravkoch na podložnom sklíčku v kvapke 10 % žieravého alkalického roztoku alebo zmesi alkoholu a glycerínu v rovnakých objemoch alebo v zafarbených náteroch (tabuľka 3).

Inokulácia patologického materiálu sa uskutočňuje na vyššie uvedené živné pôdy v Petriho miskách pomocou bakteriologickej špachtle podľa všeobecne uznávanej metódy.

2.5. Mikroskopické vyšetrenie a výsev patologického materiálu pri dermatomykóze (keratomykóza a dermatofytóza).

Predmetom štúdie sú povrchové mykózy, ktoré postihujú iba keratínovú vrstvu epidermy, a dermatofyty, ktoré postihujú kožu a jej prívesky (vlasy, nechty), ktorých pôvodcami sú plesne súvisiace s pôrodom. Trichophyton, Microsporum a Epidermophyton.

Laboratórne mykologické vyšetrenie zahŕňa rovnaké kroky ako pri iných mykózach: mikroskopovanie materiálu a získanie čistej kultúry pri jej výseve. Správny odber materiálu vo veľkej miere ovplyvňuje úspech mikroskopie a kultivácie.

Patologický materiál sa vyšetruje čo najskôr po odbere. Predtým sa delila na tri časti: na mikroskopiu, kultiváciu a opätovné vyšetrenie. Mikroskopia patologického materiálu je najjednoduchšia a najrýchlejšia metóda na zistenie prítomnosti huby v tkanivách. Rozdrvený materiál sa vloží do stredu podložného skla v kvapke 10-20% roztoku KOH a mierne sa zahrieva nad plameňom liehovej lampy, až kým sa pozdĺž okraja kvapky nezíska belavý okraj, prekrytý krycím sklíčkom. a nechá sa 5-10 minút (vlasy, šupiny kože) a 30-40 minút (nechty) na maceráciu a osvietenie; materiál je možné spracovať bez zahrievania, preto sa prípravok nechá 30-60 minút v 20% roztoku KOH.

Mikroskopicky najskôr pod malým, potom veľkým zväčšením mikroskopu.

Kultúrne vyšetrenie je nevyhnutné na izoláciu a identifikáciu patogénu. Naočkovaný materiál sa čo najviac rozdrví a naočkuje v minimálnych množstvách na šikmý agar v skúmavkách v 2-3 bodoch vo vzdialenosti 1-2 cm.Minimálne 2-3 skúmavky (vlasy) a 4-5 skúmaviek (kožné a nechtové šupiny) sa naočkujú materiálom jednej vzorky. Na primárnu izoláciu dermatofytov je najlepšie použiť štandardné Sabouraudovo agarové médium s 2-4% glukózovým alebo mladinovým agarom obsahujúcim antibakteriálne antibiotiká (penicilín 50 µg/ml + streptomycín 50 µg/ml alebo biomycín 200 jednotiek/ml) a antimikrobiálne látky. -antibiotikum proti plesniam (cykloheximid) 0,1 - 0,5 mg / ml. Actidion neovplyvňuje rast dermatofytov a inhibuje mnohé plesne, ako aj druhy Candida a Cryptococcus.

Inokulácie sa inkubujú pri 22-30 °C (výhodne 28 °C). Vzhľad rastu dermatofytov sa pozoruje od 4 do 12 dní inkubácie v miestach výsevu pozdĺž okrajov zavedeného materiálu. Ak nedôjde k rastu do 30 dní, výsledky kultivácie sa považujú za negatívne. Za optimálnych podmienok možno primárne kultúry mnohých dermatofytov identifikovať 7-10 dní po inokulácii, ale kultúry by sa mali monitorovať 20-30 dní. Primárne kultúry rastú relatívne pomaly a pri použití médií bez antibiotík môžu byť dermatofyty premožené rýchlejšie rastúcimi baktériami alebo plesňami. Keď sa rast objaví v primárnej inokulácii, je potrebné vykonať skríning od okraja kolónie na čerstvé diferenciálne médium, aby sa získala čistá kultúra, ktorá bude slúžiť ako materiál na identifikáciu izolovaného dermatofytu.

2.6. Sérologické metódy na diagnostiku mykóz

Hodnota sérologických metód spočíva najmä v: identifikácia pacientov s pravdepodobnými invazívnymi mykózami; potvrdenie mykotickej povahy alergických ochorení; skríningové vyšetrenie rizikových skupín pre vznik mykóz.

Falošne pozitívne výsledky sérologických testov sú možné pri mykocarióze a u zdravých ľudí senzibilizovaných hubovými antigénmi, negatívne testy môžu byť pri imunodeficiencii aj na pozadí prebiehajúcej invazívnej mykózy.

Rutinné konvenčné metódy na sérologickú diagnostiku mykóz
dostatočne podrobne popísané /P.N.Kashkin, V.V.Lisin. "Praktické
sprievodca lekárskou mykológiou“, Medicína, 1983/. Avšak v nedávnej dobe
desaťročia došlo k badateľným posunom v metodických prístupoch / Elinov N.P.,
2001/. Navrhnuté originálne postupy na detekciu antigénov a protilátok
niektoré metabolity buniek húb; vytvoril špeciálnu diagnostiku
súpravy („veľryby“), napríklad Pastorex ® Candida, na stanovenie v
reakcie "latexovej aglutinácie" opakovaných oligomanózových epitopov antigénu
štruktúry / vyjadrené na veľkom počte makromolekúl
huba; na stanovenie Candida mannanového antigénu, napríklad v
sérum pacienta s kandidémiou možno použiť súpravu Platelia ® Candida.
Pri použití prvej sady je prah na stanovenie antigénnych štruktúr 2,5 ng / ml, pri použití druhej v spojení s metódou _____________ je prah na stanovenie - 0,5 ng/ml.

Pôvodcovia mykóz, najčastejšie detegovaní v laboratórnych štúdiách rôznych klinických materiálov

Krv

• Candida
• Cryptococcus
• Mycéliové patogény sú zriedkavo zistené v krvných testoch, s výnimkou Fusarium

cerebrospinálny mok

• Candida
• Cryptococcus

Hnis vytekajúci z abscesov, vredov atď.

• Candida
• Cryptococcus
• Fusarium
• Aspergillus
• Sporotrix

Respiračné sekréty (spútum, BAL, biopsia bronchiálnej kefky, transtracheálny aspirát)

• Aspergillus
• Candida
• Cryptococcus
• Mucor
• Scedosporium
• Rhizopus
• Sporotrix

Odnímateľný bioptický materiál z rán

• Aspergillus
• Candida
• Fusarium
• Rhizopus

Iné biosubstráty

• Candida
• Cryptococcus

Materiál z hrudníka, brušnej dutiny; synoviálna tekutina

• Aspergillus
• Candida
• Fusarium

sklovité telo

• Candida
• Aspergillus

IV. Kritériá diagnostiky systémových mykóz: klinické a laboratórne parametre konečnej diagnózy

Ezofagitída

• prítomnosť charakteristických zmien v ezofagoskopii
• detekcia huby počas kultivácie bioptického materiálu
• prítomnosť pseudomycélia v zafarbených náteroch alebo známky invazívneho rastu húb v bioptickom materiáli

Zápal pľúc

Pneumónia spôsobená Candida spp.

• akútne infiltratívne zmeny na röntgenovom snímku pľúc, ktoré sa zhodujú s klinické prejavy plesňový zápal pľúc
• detekcia Candida spp. Pri kultivácii materiálu z odpadu dolných dýchacích ciest získaného z transtorakálnej biopsie, transbronchiálnej biopsie, nálezov z pľúcnej biopsie alebo toroskopicky riadenej biopsie
• detekcia pseudomycélia v adekvátne zafarbenom bioptickom materiáli

Pneumónia spôsobená Aspergillus spp., Fusarium spp., Scedosporium apiospermum

• detekcia hubových prvkov v tkanivách a pozitívna kultúra
• perzistentné alebo progresívne pľúcne infiltráty rezistentné na antibiotickú liečbu
• detekcia jedného z uvedených patogénov počas kultivácie spúta alebo BAL
• klinické príznaky pneumónie (kašeľ, dýchavičnosť, "pleurálna" bolesť, sipot, pleurálne trenie)
• charakteristické zmeny na RTG alebo CT pľúc:

Subpleurálne infiltratívne, nodulárne zmeny s ostrým uhlom alebo kavernózne zmeny

Halo znak na pľúcnom CT

Progresia infiltratívnych zmien s tvorbou dutín a objavením sa „kosákového“ symptómu

• neprítomnosť iných patogénov počas kultivácie BAL, ktoré by mohli spôsobiť prezentované zmeny v pľúcach

Sínusitída

• klinické a rádiografické znaky akútnej sinusitídy
• mikroskopické a kultúrne známky mykózy pri štúdiu aspirátu alebo bioptického materiálu

Infekcie močových ciest

• >1 x 10 cfu/ml detegované na opakovaných kultúrach správne odobraného moču

fungémia

• Jednorazová detekcia húb počas hemokultúry pri zvýšení telesnej teploty > 38 °C

Akútna diseminovaná mykóza

• Fungémia v kombinácii s kultúrnymi alebo histologickými znakmi poškodenia hlbokého tkaniva (vrátane podkožného tkaniva) alebo identifikáciou patogénu z dvoch normálne sterilných biosubstrátov

Endoftalmitída

• oftalmické príznaky endoftalmitídy
• identifikácia patogénu z oka, krvi alebo iných ohniskov šírenia

Absces alebo osteomyelitída

• rádiografické/CT/MRI príznaky osteomyelitídy
• identifikácia patogénu v aspiráte alebo bioptickom materiáli

Meningitída

• stanovenie zmien CSF, potvrdenie prítomnosti zápalu a detekcia húb mikroskopiou CSF
• detekcia húb kultiváciou CSF alebo detekciou antigénu Cr.neoformans, Candida a Aspergillus v CSF

Chronická diseminovaná (hepatolienálna) kandidóza

možné

• pretrvávajúca alebo intermitentná horúčka po skončení obdobia neutropénie v kombinácii s charakteristické znaky poškodenie pečene, sleziny alebo obličiek

Osvedčené

• vyššie uvedené kombinované s výsevom Candida spp. z krvi pred objavením sa príznakov poškodenia pečene, sleziny alebo obličiek alebo s kultúrnymi, histologickými príznakmi kandidózy v bioptickom materiáli z ložísk

V. PRÍČINY HUBOVÝCH INFEKCIÍ

Existujú rôzne princípy klasifikácie plesňových infekcií a ich patogénov. Prakticky najjednoduchšie a najúčelnejšie sa nám zdá rozdeliť patogénne huby do 5 hlavných skupín:

1. Patogény povrchových mykóz;

2. Pôvodcovia dermatomykózy;

3. Patogény subkutánnych mykóz;

4. Pôvodcovia hlbokých mykóz (primárne patogénne mikromycéty, patogény oportúnnych infekcií).

5. Pôvodcovia pseudomykóz.

* Treba zdôrazniť, že patogény prvých troch skupín u imunosuprimovaných pacientov môžu spôsobiť fungémiu a lézie viacerých orgánov.

V nasledujúcich častiach uvádzame popis pôvodcov mykóz podľa jednotnej schémy: ich názov podľa prijatej nomenklatúry, zoznam synoným, makroskopický popis kolónií na živných pôdach a mikroskopický popis hubových prvkov. viditeľné pod mikroskopom v natívnych preparátoch a z kolónií. Uvádzajú sa aj údaje o rozšírení húb v prírode a sú uvedené choroby, ktoré spôsobujú.

Klinický obraz plesňových ochorení kože je veľmi polymorfný, preto musí byť diagnóza vo všetkých prípadoch potvrdená laboratórnymi výskumnými metódami. Na laboratórnu diagnostiku mykóz sa používajú mikroskopické, luminiscenčné, kultúrne, imunologické (alergologické a sérologické) metódy výskumu, ako aj pokusy na zvieratách.

Laboratórna diagnostika mykóz pozostáva z niekoľkých etáp. V bežnej klinickej praxi sa zvyčajne obmedzujú na mikroskopické a kultivačné vyšetrenie infikovaného materiálu. V prípade potreby sú tieto metódy doplnené o imunologické, histologické štúdie, infekcia pokusných zvierat. Pri niektorých kožných mykózach zohráva významnú pomocnú úlohu v diagnostike luminiscenčná metóda.

Odoberanie patologického materiálu.

Úspech laboratórnej štúdie mykóz do značnej miery závisí od správneho odberu patologického materiálu. Keďže huby sú schopné infikovať rôzne ľudské orgány, pri podozrení na mykózu je potrebné vyšetriť rôzne patologické materiály. V dermatologickej praxi sa najčastejšie musíte potýkať s mykózami, pri ktorých sa kožné šupiny, vlasy a nechty podrobujú vyšetreniu na plesne. Pri podozrení na hlboké a systémové mykózy môže byť potrebné laboratórne diagnostikovať plesne spúta, výplachov, moču, stolice, hnisu, sekrétov slizníc, krvi, kúskov orgánov a biopsie tkaniva.

Pri kožných léziách, z ktorých sa má odoberať patologický materiál, je potrebné o niekoľko dní či týždňov celú liečbu ukončiť. Treba mať na pamäti, že použitie slabých dezinfekčných prostriedkov alebo dokonca indiferentných prostriedkov môže zasahovať do štúdie. Bezprostredne pred odberom patologického materiálu je potrebné léziu ošetriť 96% roztokom alkoholu alebo xylénu. Materiál sa najlepšie odoberá z čerstvých, ale už plne vyvinutých lézií. Z periférie ložísk treba zoškrabať kožné šupiny, najčastejšie sa tu vyskytujú plesne vo forme mycélia aj spór. Kožné šupiny sa odstraňujú skalpelom, kôry - epilačnou pinzetou.

U pacientov s mykózou pokožky hlavy sa postihnuté chĺpky odstraňujú epilačnou pinzetou. Na výskum je potrebné vziať krátke, skrútené, zakrivené vo forme oblúka alebo čiarky, ako aj dlhé, ale na základni pokryté plášťom. Ak máte podozrenie na favus, musíte si uvedomiť, že vlasy sa neodlomia, ale stanú sa matnými, bez života, sivastými.

Škrabky z povrchových ložísk postihnutých nechtových platničiek sa robia skalpelom, zhrubnuté nechtové platničky sa odrežú skalpelom alebo nožnicami na nechty.

Tekutý patologický materiál sa zhromažďuje asepticky do sterilných misiek, kožných vločiek, nechtov a vlasov - na listy obyčajného alebo mäkkého pergamenového papiera.

Oddeliteľné od slizníc na očkovanie sa odoberie tampónom z savej vaty, ktorý sa potom vloží do suchej sterilnej skúmavky alebo skúmavky s 2 ml živného média (Saburo's wort). Materiál z vagíny sa získava zo zadného fornixu; z hlavy penisu - z oblasti koronálneho sulku.

Materiál z vonkajšieho zvukovodu sa odoberá slučkou alebo tampónom, ktorý sa vloží do skúmavky.

Materiál prijatý do laboratória sa vyšetrí do 1 hodiny po odbere pri skladovaní pri izbovej teplote alebo maximálne do 3 hodín pri skladovaní v chladničke pri teplote 4 °C.

Krv na výskum húb sa odoberie z loketnej žily v množstve 5-10 ml a ihneď sa pridá do banky s tekutým živným médiom alebo rovnakým množstvom citranu sodného.

Ak je potrebné študovať bioptický materiál na huby, vloží sa do sterilnej Petriho misky a použije sa na mikroskopiu, očkovanie na živné pôdy a prípravu histologických preparátov.

Mikroskopické vyšetrenie.

Mikroskopické vyšetrenie patologického materiálu na huby sa vykonáva v natívnych a farbených prípravkoch. Na prípravu nefarbených prípravkov sa výsledný materiál rozdrví skalpelom alebo pitevnou ihlou a umiestni sa do stredu podložného skla. Pre jasnejšiu identifikáciu prvkov huby sa materiál číri (maceruje). Na tento účel siahajú za pomoci rôznych látok, najčastejšie žieravých alkálií (KOH, NaOH), ktoré rozpúšťajú epidermálne šupiny, hlieny, hnis, prejasňujú vlasový pigment a sprístupňujú tak huby pre výskum.

V niektorých laboratóriách sa čírenie prípravkov na mikroskopické vyšetrenie vykonáva 15 - 30 % roztokom KOH, do ktorého sa pridáva 5 - 10 % komerčného tmavomodrého atramentu Parker (Parker's Superchrome Blue-BlackInk). a spóry sú sfarbené na modro.