Tikai par kompleksu: kā gēnu terapija darbojas un ko tā ārstē. Ģenētiskās slimības — ārstēšana Vācijā gēnu mediēta enzīmu priekšzāļu terapija

Savas salīdzinoši īsās vēstures laikā gēnu terapija ir piedzīvojusi "kāpumus un kritumus": dažreiz zinātnieki un praktiķi to uzskatīja par gandrīz panaceju, un tad sekoja vilšanās un skepticisma periods...
Idejas par iespēju ievadīt organismā gēnus terapeitiskos nolūkos izskanēja pagājušā gadsimta 60. gadu sākumā, bet reāli soļi tika sperti tikai 80. gadu beigās un bija cieši saistīti ar starptautisko projektu cilvēka genoma atšifrēšanai.

1990. gadā tika mēģināts veikt gēnu terapiju smagam, bieži vien ar dzīvību nesavienojamam iedzimtam imūndeficītam, ko izraisīja gēna defekts, kas kodē enzīma adenozīna deamināzes sintēzi. Pētījuma autori ziņoja par skaidru terapeitisko efektu. Un, lai gan laika gaitā radās vairākas šaubas par iegūtā efekta noturību un tā specifiskajiem mehānismiem, tieši šis darbs kalpoja par spēcīgu stimulu gēnu terapijas attīstībai un piesaistīja vairāku miljardu dolāru investīcijas.

Gēnu terapija ir medicīniska pieeja, kuras pamatā ir gēnu konstrukciju ievadīšana šūnās ārstēšanai dažādas slimības. Vēlamais efekts tiek sasniegts vai nu ievadītā gēna ekspresijas rezultātā, vai arī nomācot bojātā gēna darbību. Jāuzsver, ka gēnu terapijas mērķis nav gēnu kā tādu "ārstēšana", bet gan dažādu slimību ārstēšana ar to palīdzību.

Kā likums, DNS fragmentu, kas satur vajadzīgo gēnu, izmanto kā "narkotiku". Tā var būt vienkārši “kaila DNS”, parasti kombinācijā ar lipīdiem, olbaltumvielām utt. Taču daudz biežāk DNS tiek ieviesta kā daļa no īpašām ģenētiskām konstrukcijām (vektoriem), kas izveidotas uz dažādu cilvēku un dzīvnieku vīrusu bāzes, izmantojot vairākus gēnu inženierijas manipulācijas. Piemēram, no vīrusa tiek izņemti tā pavairošanai nepieciešamie gēni. Tas, no vienas puses, padara vīrusu daļiņas praktiski drošas, no otras puses, tas “atbrīvo vietu” gēniem, kas paredzēti ievadīšanai organismā.

Gēnu terapijas pamatpunkts ir gēnu konstrukcijas iekļūšana šūnā (transfekcija), vairumā gadījumu tās kodolā. Tajā pašā laikā ir svarīgi, lai gēna konstrukcija sasniegtu tieši tās šūnas, kuras ir “jāārstē”. Tāpēc gēnu terapijas panākumi lielā mērā ir atkarīgi no optimālās vai vismaz apmierinošās metodes izvēles gēnu konstrukciju ievadīšanai organismā.

Ar vīrusu vektoriem situācija ir vairāk vai mazāk paredzama: tie izplatās pa visu organismu un iekļūst šūnās tāpat kā to vecāku vīrusi, nodrošinot diezgan augstu orgānu un audu specifiku. Šādas konstrukcijas parasti ievada intravenozi, intraperitoneāli, subkutāni vai intramuskulāri.

Ir izstrādātas vairākas īpašas metodes nevīrusu vektoru "mērķtiecīgai piegādei". Vienkāršākā metode vēlamā gēna ievadīšanai šūnās in vivo ir tieša ģenētiskā materiāla ievadīšana audos. Šīs metodes izmantošana ir ierobežota: injekcijas var veikt tikai ādā, aizkrūts dziedzerī, šķērssvītrotajos muskuļos, dažos cietos audzējos.

Vēl viena transgēnu piegādes metode ir ballistiskā transfekcija. Tā pamatā ir orgānu un audu "lobīšana" ar smago metālu (zelta, volframa) mikrodaļiņām, kas pārklātas ar DNS fragmentiem. "Apšaušanai" viņi izmanto īpašu "gēnu lielgabalu".

Plaušu slimību ārstēšanā ir iespējams ievadīt ģenētisko materiālu elpceļos aerosola veidā.

Šūnu transfekciju var veikt arī ex vivo: šūnas tiek izolētas no ķermeņa, ģenētiski modificētas ar tām un pēc tam injicētas atpakaļ pacienta ķermenī.

Mēs ārstējam: iedzimtu ...

Uz sākuma stadija gēnu terapijas attīstība, tās galvenie objekti tika uzskatīti par iedzimtām slimībām, ko izraisīja viena gēna trūkums vai nepietiekama funkcija, tas ir, monogēnas. Tika pieņemts, ka normāli funkcionējoša gēna ievadīšana pacientam novedīs pie slimības izārstēšanas. Atkārtoti tika mēģināts ārstēt "karalisko slimību" - hemofiliju, Dišēna miodistrofiju, cistisko fibrozi.

Mūsdienās tiek izstrādātas un pārbaudītas gēnu terapijas metodes gandrīz 30 cilvēka monogēnām slimībām. Tikmēr jautājumu ir vairāk nekā atbilžu, un reālais terapeitiskais efekts vairumā gadījumu nav sasniegts. Iemesli tam, pirmkārt, ir organisma imūnā atbilde, pakāpeniska ievadītā gēna funkciju "izbalēšana", kā arī nespēja panākt pārnestā gēna "mērķtiecīgu" integrāciju hromosomu DNS.

Mazāk nekā 10% gēnu terapijas pētījumu ir veltīti monogēnām slimībām, bet pārējie attiecas uz nepārmantotām patoloģijām.

…un ieguvis

Iegūtās slimības nav saistītas ar iedzimtiem defektiem gēnu struktūrā un darbībā. Viņu gēnu terapija balstās uz pieņēmumu, ka "terapeitiskā gēna" ievadīšanai organismā vajadzētu izraisīt proteīna sintēzi, kam būs vai nu terapeitisks efekts, vai arī palielinās individuālā jutība pret darbību. zāles.

Gēnu terapiju var izmantot trombozes profilaksei, sirds muskuļa asinsvadu sistēmas atjaunošanai pēc miokarda infarkta, aterosklerozes profilaksei un ārstēšanai, kā arī cīņā pret HIV infekciju un. onkoloģiskās slimības. Piemēram, intensīvi tiek izstrādāta tāda audzēja gēnu terapijas metode kā audzēja šūnu jutības paaugstināšana pret ķīmijterapijas zālēm, tiek veikti klīniskie pētījumi, kuros piedalās pacienti ar pleiras mezoteliomu, olnīcu vēzi, glioblastomu. 1999. gadā tika apstiprināts prostatas vēža ārstēšanas protokols, izvēlētas drošas ķīmijterapijas zāļu devas un uzrādīti pozitīvi rezultāti. dziedinošs efekts.

Drošība un ētika

Ģenētisku manipulāciju veikšana ar cilvēka ķermeni uzliek īpašas drošības prasības: galu galā jebkura sveša ģenētiskā materiāla ievadīšana šūnās var radīt negatīvas sekas. Nekontrolēta "jaunu" gēnu ievietošana noteiktās pacienta genoma daļās var izraisīt "savu" gēnu darbības traucējumus, kas, savukārt, var izraisīt nevēlamas izmaiņas organismā, jo īpaši vēža audzēju veidošanos.

Turklāt somatiskajās un dzimumšūnās var rasties negatīvas ģenētiskas izmaiņas. Pirmajā gadījumā runa ir par viena cilvēka likteni, kur ar ģenētisko korekciju saistītais risks ir nesalīdzināmi mazāks par nāves risku no esošas slimības. Kad gēnu konstrukcijas tiek ievadītas dzimumšūnās, nevēlamās izmaiņas genomā var tikt nodotas nākamajām paaudzēm. Tāpēc šķiet gluži dabiski mēģināt aizliegt dzimumšūnu ģenētiskās modifikācijas eksperimentus ne tikai medicīnisku, bet arī ētisku apsvērumu dēļ.

Vairākas morālas un ētiskas problēmas ir saistītas ar gēnu iejaukšanās pieeju izstrādi jaunattīstības cilvēka embrija šūnās, tas ir, ar intrauterīnu gēnu terapiju (in utero terapija). Amerikas Savienotajās Valstīs in utero gēnu terapija tiek apsvērta tikai divu visnopietnāko ģenētisko slimību gadījumā: smags kombinēts imūndeficīts, ko izraisa enzīma adenozīna deamināzes gēna defekts, un homozigota beta-talasēmija, smaga iedzimta slimība. kas saistīti ar visu četru globīna gēnu vai mutāciju neesamību tajos. Jau ir izstrādātas un iepriekšējai pārbaudei tiek gatavotas vairākas gēnu konstrukcijas, kuru nogādāšana organismā paredz ģenētisko defektu kompensāciju un šo slimību simptomu likvidēšanu. Tomēr šādu manipulāciju negatīvo ģenētisko seku risks ir diezgan augsts. Tāpēc arī intrauterīnās gēnu terapijas ētika joprojām ir pretrunīga.

Šā gada janvārī ASV atkal uz laiku tika aizliegti eksperimenti ar gēnu terapiju. Iemesls bija bīstamas komplikācijas kas radās diviem bērniem pēc iedzimta imūndeficīta gēnu terapijas. Pirms dažiem mēnešiem Francijā vienam no bērniem, kas tika uzskatīti par izārstētiem ar gēnu terapiju, tika atklāts leikēmijai līdzīgs sindroms. Speciālisti neizslēdz, ka tieši uz retrovīrusiem balstītu vektoru lietošana terapijas laikā var būt par cēloni komplikāciju attīstībai bērniem. Tagad Pārtikas kontroles pārvaldes pārstāvji un zāles(FDA) apsvērs iespēju turpināt gēnu terapijas eksperimentus katrā gadījumā atsevišķi un tikai tad, ja slimībai nav citu ārstēšanas līdzekļu.

Nevis panaceja, bet perspektīva

Nevar noliegt, ka patiesie gēnu terapijas panākumi konkrētu pacientu ārstēšanā ir visai pieticīgi, un pati pieeja vēl ir datu uzkrāšanas un tehnoloģiju attīstības stadijā. Gēnu terapija nav kļuvusi un, acīmredzot, nekad arī nebūs panaceja. Ķermeņa regulējošās sistēmas ir tik sarežģītas un tik maz pētītas, ka vienkārša gēna ievadīšana vairumā gadījumu nedod vēlamo terapeitisko efektu.

Tomēr ar visu šo gēnu terapijas izredzes diez vai var pārvērtēt. Ir pamats cerēt, ka progress molekulārās ģenētikas un gēnu inženierijas tehnoloģiju jomā nesīs neapšaubāmus panākumus cilvēku slimību ārstēšanā ar gēnu palīdzību. Un galu galā gēnu terapija pamatoti ieņems savu vietu praktiskajā medicīnā.

Acīmredzot gēnu terapijai var būt daži negaidīti pielietojumi. Pēc zinātnieku domām, 2012. gadā tiks rīkotas olimpiskās spēles, kurās uzstāsies transgēnie supersportisti. "DNS dopings" dos neapšaubāmas priekšrocības
spēka, izturības un ātruma attīstībā. Nav šaubu, ka sīvās konkurences apstākļos būs sportisti, kuri ir gatavi ģenētiskai modifikācijai, pat ņemot vērā iespējamos riskus, kas saistīti ar jauno tehnoloģiju izmantošanu.

Piezīme!

Šis darbs tika iesniegts populārzinātnisko rakstu konkursam nominācijā "Labākais apskats".

Nāves spīles

Cilvēce saskārās ar šo noslēpumaino slimību pat pirms mūsu ēras. Zinātnieki mēģināja viņu izprast un ārstēt dažādās pasaules malās: Senajā Ēģiptē - Ebers, Indijā - Sušruta, Grieķijā - Hipokrāts. Viņi visi un daudzi citi ārsti cīnījās pret bīstamu un nopietnu pretinieku – vēzi. Un, lai gan šī cīņa turpinās līdz pat šai dienai, ir grūti noteikt, vai ir iespēja gūt pilnīgu un galīgu uzvaru. Galu galā, jo vairāk mēs pētām slimību, jo biežāk rodas jautājumi - vai ir iespējams pilnībā izārstēt vēzi? Kā izvairīties no slimībām? Vai ir iespējams padarīt ārstēšanu ātru, pieejamu un lētu?

Pateicoties Hipokrātam un viņa novērojumam (tieši viņš redzēja audzēja un vēža taustekļu līdzību), šis termins parādījās senos medicīnas traktātos. karcinoma(grieķu carcinos) vai vēzis(lat. vēzis). Medicīnas praksē ļaundabīgos audzējus klasificē dažādi: karcinomas (no epitēlija audiem), sarkomas (no saistaudiem, muskuļu audiem), leikēmijas (asinīs un kaulu smadzenēs), limfomas (no epitēlija audiem). limfātiskā sistēma) un citi (attīstās citos šūnu tipos, piemēram, glioma - smadzeņu vēzis). Taču ikdienā populārāks ir termins "vēzis", kas nozīmē jebkuru ļaundabīgu audzēju.

Mutācijas: iet bojā vai dzīvot mūžīgi?

Daudzi ģenētiski pētījumi ir parādījuši, ka vēža šūnu rašanās ir ģenētisku izmaiņu rezultāts. Kļūdas DNS replikācijā (kopēšanā) un labošanā (kļūdu labošanā) izraisa izmaiņas gēnos, tostarp tajos, kas kontrolē šūnu dalīšanos. Galvenie faktori, kas veicina genoma bojājumus un tālāk mutāciju iegūšanu, ir endogēni (uzbrukums brīvie radikāļi veidojas vielmaiņas laikā, dažu DNS bāzu ķīmiskā nestabilitāte) un eksogēni (jonizējošais un UV starojums, ķīmiskie kancerogēni). Kad mutācijas tiek fiksētas genomā, tās veicina normālu šūnu pārvēršanos vēža šūnās. Šādas mutācijas galvenokārt rodas proto-onkogēnos, kas parasti stimulē šūnu dalīšanos. Rezultātā var iegūt pastāvīgi "ieslēgtu" gēnu, un mitoze (dalīšanās) neapstājas, kas patiesībā nozīmē ļaundabīgu deģenerāciju. Ja gēnos, kas parasti inhibē proliferāciju (audzēja supresoru gēnos), rodas inaktivējošas mutācijas, tiek zaudēta kontrole pār dalīšanos un šūna kļūst "nemirstīga" (1. att.).

1. attēls. Vēža ģenētiskais modelis: resnās zarnas vēzis. Pirmais solis ir divu APS gēna alēļu zaudēšana vai inaktivācija piektajā hromosomā. Ģimenes vēža gadījumā (pazīstama adenomatozā polipoze, FAP) tiek mantota viena APC gēna mutācija. Abu alēļu zudums izraisa labdabīgu adenomu veidošanos. Sekojošas labdabīgas adenomas 12., 17., 18. hromosomu gēnu mutācijas var izraisīt transformāciju ļaundabīgā audzējā. Avots: .

Acīmredzot noteiktu vēža veidu attīstība ietver izmaiņas lielākajā daļā vai pat visu šo gēnu un var notikt dažādos veidos. No tā izriet, ka katrs audzējs ir jāuzskata par bioloģiski unikālu objektu. Līdz šim ir īpašas ģenētiskās informācijas datu bāzes par vēzi, kas satur datus par 1,2 miljoniem mutāciju no 8207 audu paraugiem, kas pieder pie 20 audzēju veidiem: vēža genoma atlants un vēža somatisko mutāciju katalogs (COSMIC).

Gēnu mazspējas rezultāts ir nekontrolēta šūnu dalīšanās, un turpmākajos posmos - metastāzes uz dažādiem orgāniem un ķermeņa daļām caur asinīm un limfātiskajiem asinsvadiem. Tas ir diezgan sarežģīts un aktīvs process, kas sastāv no vairākiem posmiem. Atsevišķas vēža šūnas tiek atdalītas no primārā fokusa un tiek pārnestas ar asinīm visā ķermenī. Pēc tam ar īpašu receptoru palīdzību tie piesaistās endotēlija šūnām un ekspresē proteināzes, kas šķeļ matricas proteīnus un veido poras bazālajā membrānā. Iznīcinot ekstracelulāro matricu, vēža šūnas dziļi migrē veselos audos. Pateicoties autokrīnai stimulācijai, tie sadalās, veidojot mezglu (1-2 mm diametrā). Ar nepietiekamu uzturu dažas mezgla šūnas mirst, un šādas “aktīvās” mikrometastāzes orgāna audos var palikt latentas diezgan ilgu laiku. Labvēlīgos apstākļos mezgls aug, šūnās aktivizējas asinsvadu endotēlija augšanas faktora (VEGF) un fibroblastu augšanas faktora (FGFb) gēni un tiek uzsākta angioģenēze (asinsvadu veidošanās) (2. att.).

Tomēr šūnas ir bruņotas ar īpašiem mehānismiem, kas aizsargā pret audzēju attīstību:

Tradicionālās metodes un to trūkumi

Ja organisma aizsargsistēmas neizdevās un audzējs tomēr sāka attīstīties, glābt var tikai medicīniska iejaukšanās. Ilgu laiku ārsti ir izmantojuši trīs galvenās "klasiskās" terapijas:

• ķirurģiska (pilnīga audzēja noņemšana). To lieto, ja audzējs ir mazs un labi lokalizēts. Noņemiet arī daļu no audiem, kas saskaras ar ļaundabīgo audzēju. Metode netiek piemērota metastāžu klātbūtnē;
• starojums - audzēja apstarošana ar radioaktīvām daļiņām, lai apturētu un novērstu vēža šūnu dalīšanos. Veselas šūnas arī ir jutīgas pret šo starojumu un bieži iet bojā;
• ķīmijterapija - tiek lietoti medikamenti, kas kavē strauji dalīšanās šūnu augšanu. Narkotikas negatīvi ietekmē normālas šūnas.

Iepriekš minētās pieejas ne vienmēr var glābt pacientu no vēža. Bieži vien ķirurģiskas ārstēšanas laikā paliek atsevišķas vēža šūnas, un audzējs var atkārtoties, un ķīmijterapijas un staru terapijas laikā rodas blakus efekti(samazināta imunitāte, anēmija, matu izkrišana utt.), kas izraisa nopietnas sekas un bieži vien līdz pacienta nāvei. Taču tradicionālās ārstēšanas metodes ar katru gadu uzlabojas un parādās jaunas ārstēšanas metodes, kas var uzveikt vēzi, piemēram, bioloģiskā terapija, hormonterapija, cilmes šūnu izmantošana, kaulu smadzeņu transplantācija, kā arī dažādas atbalstošas ​​terapijas. Gēnu terapija tiek uzskatīta par visdaudzsološāko, jo tā ir vērsta uz vēža galveno cēloni - kompensāciju par noteiktu gēnu darbības traucējumiem.

Gēnu terapija kā perspektīva

Saskaņā ar PubMed, interese par vēža gēnu terapiju (HT) strauji pieaug, un mūsdienās HT apvieno vairākas metodes, kas iedarbojas uz vēža šūnām un organismā. in vivo) un ārpus tās ( ex vivo) (3. att.).

3. attēls. Divas galvenās gēnu terapijas stratēģijas. Ex vivo- ģenētisko materiālu ar vektoru palīdzību pārnes kultūrā audzētās šūnās (transdukcija), un pēc tam transgēnās šūnas ievada recipientā; in vivo- vektora ievadīšana ar vēlamo gēnu noteiktā audā vai orgānā. Attēls no .

Gēnu terapija in vivo ietver gēnu pārnesi - ģenētisku konstrukciju ievadīšanu vēža šūnās vai audos, kas ieskauj audzēju. Gēnu terapija ex vivo sastāv no vēža šūnu izolēšanas no pacienta, terapeitiskā "veselīgā" gēna ievietošanas vēža genomā un transducēto šūnu ievadīšanas atpakaļ pacienta ķermenī. Šādiem nolūkiem tiek izmantoti īpaši gēnu inženierijas radīti vektori. Parasti tie ir vīrusi, kas atklāj un iznīcina vēža šūnas, vienlaikus paliekot nekaitīgi veseliem ķermeņa audiem vai ne-vīrusu vektoriem.

Vīrusu vektori

Kā vīrusu pārnēsātāji tiek izmantoti retrovīrusi, adenovīrusi, ar adeno saistītie vīrusi, lentivīrusi, herpes vīrusi un citi. Šie vīrusi atšķiras pēc transdukcijas efektivitātes, mijiedarbības ar šūnām (atpazīšana un infekcija) un DNS. Galvenais kritērijs ir vīrusa DNS nekontrolētas izplatīšanās drošība un riska trūkums: ja gēni tiek ievietoti nepareizā vietā cilvēka genomā, tie var radīt kaitīgas mutācijas un ierosināt audzēja attīstību. Svarīgi ir arī ņemt vērā pārnesto gēnu ekspresijas līmeni, lai mērķa proteīnu hipersintēzes laikā novērstu organisma iekaisuma vai imūnās reakcijas (1. tabula).

Nevīrusu vektori

Nevīrusu vektorus izmanto arī transgēnās DNS pārnešanai. Polimēru zāļu nesējus - nanodaļiņu konstrukcijas - izmanto, lai piegādātu zāles ar zemu molekulmasu, piemēram, oligonukleotīdus, peptīdus, miRNS. Pateicoties mazs izmērs, nanodaļiņas absorbē šūnas un var iekļūt kapilāros, kas ir ļoti ērti, lai nogādātu "dziedinošās" molekulas uz visnepieejamākajām ķermeņa vietām. Šo metodi bieži izmanto, lai inhibētu audzēja angioģenēzi. Bet pastāv risks, ka daļiņas uzkrājas citos orgānos, piemēram, kaulu smadzenēs, kas var izraisīt neparedzamas sekas. Populārākās ne-vīrusu DNS piegādes metodes ir liposomas un elektroporācija.

Sintētisks katjonu liposomas tagad ir atzīti par daudzsološu veidu funkcionālu gēnu piegādei. Pozitīvais lādiņš uz daļiņu virsmas nodrošina saplūšanu ar negatīvi lādētām šūnu membrānām. Katjonu liposomas neitralizē DNS ķēdes negatīvo lādiņu, padara tās telpisko struktūru kompaktāku un veicina efektīvu kondensāciju. Plazmīdu-liposomu kompleksam ir vairākas svarīgas priekšrocības: tajos var ievietot praktiski neierobežota izmēra ģenētiskās konstrukcijas, nepastāv replikācijas vai rekombinācijas risks un praktiski neizraisa imūnreakciju saimniekorganismā. Šīs sistēmas trūkums ir īss terapeitiskā efekta ilgums, un ar atkārtotu ievadīšanu var rasties blakusparādības.

elektroporācija ir populāra ne-vīrusu DNS piegādes metode, kas ir diezgan vienkārša un neizraisa imūnreakciju. Ar inducēto palīdzību elektriskie impulsi uz šūnu virsmas veidojas poras, un plazmīda DNS viegli iekļūst intracelulārajā telpā. Gēnu terapija in vivo elektroporācijas izmantošana ir pierādījusi savu efektivitāti vairākos eksperimentos ar peļu audzējiem. Var pārnest jebkurus gēnus, piemēram, citokīnu (IL-12) un citotoksiskos gēnus (TRAIL), kas veicina plaša spektra terapeitisko stratēģiju izstrādi. Turklāt šī pieeja var būt efektīva gan metastātisku, gan primāru audzēju ārstēšanā.

Tehnikas izvēle

Atkarībā no audzēja veida un tā progresēšanas pacientam tiek izvēlēta visefektīvākā ārstēšanas metode. Līdz šim ir izstrādāti jauni daudzsološi paņēmieni gēnu terapijai pret vēzi, tostarp onkolītiskā vīrusa HT, prodrug HT (prodrug therapy), imūnterapija, HT, izmantojot cilmes šūnas.

Onkolītiskā vīrusa gēnu terapija

Šai tehnikai tiek izmantoti vīrusi, kas ar īpašu ģenētisku manipulāciju palīdzību kļūst onkolītiski – veselās šūnās pārtrauc vairoties un ietekmē tikai audzēja šūnas. Labs šādas terapijas piemērs ir ONYX-015, modificēts adenovīruss, kas neizpauž E1B proteīnu. Ja šī proteīna nav, vīruss nevar vairoties šūnās ar normālu p53 gēnu. Divi vektori, kuru pamatā ir herpes simplex vīruss (HSV-1) – G207 un NV1020 – arī satur vairākas gēnu mutācijas, lai tās varētu vairoties tikai vēža šūnās. Tehnikas lielā priekšrocība ir tā, ka, veicot intravenozas injekcijas, onkolītiskie vīrusi tiek pārnesti ar asinīm pa visu ķermeni un spēj cīnīties ar metastāzēm. Galvenās problēmas, kas rodas, strādājot ar vīrusiem, ir iespējamais imūnreakcijas risks recipienta organismā, kā arī nekontrolēta ģenētisko konstrukciju integrācija veselu šūnu genomā un rezultātā vēža audzēja rašanās. .

Gēnu mediēta fermentatīvā priekšzāļu terapija

Tā pamatā ir “pašnāvniecisku” gēnu ievadīšana audzēja audos, kā rezultātā vēža šūnas mirst. Šie transgēni kodē fermentus, kas aktivizē intracelulāros citostatiskos līdzekļus, TNF receptorus un citus svarīgus komponentus apoptozes aktivizēšanai. Suicidālai priekšzāļu gēnu kombinācijai ideālā gadījumā jāatbilst šādām prasībām: kontrolēta gēnu ekspresija; izvēlētā priekšzāles pareiza pārvēršana par aktīvu pretvēža līdzekli; pilnīga priekšzāļu aktivācija bez papildu endogēniem enzīmiem.

Terapijas trūkums ir tāds, ka audzēji satur visus aizsargmehānismus, kas raksturīgi veselām šūnām, un tie pakāpeniski pielāgojas kaitīgajiem faktoriem un priekšzāles. Adaptācijas procesu veicina citokīnu ekspresija (autokrīnā regulācija), regulējošie faktori šūnu cikls(visizturīgāko vēža klonu atlase), MDR gēns (atbildīgs par jutību pret noteiktiem medikamentiem).

Imūnterapija

Pateicoties gēnu terapijai, imūnterapija pēdējā laikā ir sākusi aktīvi attīstīties - jauna pieeja vēža ārstēšanai ar pretvēža vakcīnām. Metodes galvenā stratēģija ir aktīva ķermeņa imunizācija pret vēža antigēni(TAA), izmantojot gēnu pārneses tehnoloģiju [?18].

Galvenā atšķirība starp rekombinantajām vakcīnām un citām zālēm ir tā, ka tās palīdz pacienta imūnsistēmai atpazīt vēža šūnas un tās iznīcināt. Pirmajā posmā vēža šūnas tiek iegūtas no recipienta ķermeņa (autologās šūnas) vai no īpašām šūnu līnijām (alogēnajām šūnām), un pēc tam tās audzē in vitro. Lai imūnsistēma šīs šūnas atpazītu, tiek ievadīts viens vai vairāki gēni, kas ražo imūnstimulējošas molekulas (citokīnus) vai proteīnus ar palielināts daudzums antigēni. Pēc šīm modifikācijām šūnas turpina kultivēt, pēc tam tiek veikta līze un iegūta gatavo vakcīna.

Plašs vīrusu un ne-vīrusu transgēnu vektoru klāsts ļauj eksperimentēt ar dažāda veida imūnšūnām (piemēram, citotoksiskām T šūnām un dendritiskajām šūnām), lai inhibētu imūnreakciju un regresētu vēža šūnas. Deviņdesmitajos gados tika ierosināts, ka audzēju infiltrējošie limfocīti (TIL) ir citotoksisko T limfocītu (CTL) un dabisko killer (NK) šūnu avots vēža šūnām. Tā kā TIL var viegli manipulēt ex vivo, tie kļuva par pirmajiem ģenētiski modificētajiem imūnās šūnas, kas ir pielietoti vēža imūnterapijai. T-šūnās, kas ņemtas no vēža pacienta asinīm, tiek mainīti gēni, kas ir atbildīgi par vēža antigēnu receptoru ekspresiju. Ir iespējams arī pievienot gēnus lielākai izdzīvošanai un modificētu T šūnu efektīvai iekļūšanai audzējā. Ar šādu manipulāciju palīdzību tiek radīti ļoti aktīvi vēža šūnu "slepkavas".

Kad tika pierādīts, ka lielākajai daļai vēža gadījumu ir specifiski antigēni un tie spēj izraisīt savus aizsardzības mehānismus, tika izvirzīta hipotēze, ka vēža šūnu imūnsistēmas bloķēšana atvieglos audzēja atgrūšanu. Tāpēc lielākās daļas pretvēža vakcīnu ražošanai kā antigēnu avots tiek izmantotas pacienta audzēja šūnas vai īpašas alogēnas šūnas. Galvenās audzēja imūnterapijas problēmas ir autoimūnu reakciju iespējamība pacienta organismā, pretvēža reakcijas neesamība, audzēja augšanas imūnstimulācija un citi.

cilmes šūnas

Spēcīgs gēnu terapijas instruments ir cilmes šūnu kā vektoru izmantošana terapeitisko līdzekļu - imūnstimulējošu citokīnu, "pašnāvības" gēnu, nanodaļiņu un antiangiogēno proteīnu - pārnesei. Cilmes šūnām (SC) papildus pašatjaunošanās un diferenciācijas spējai ir milzīgas priekšrocības salīdzinājumā ar citām transporta sistēmām (nanopolimēriem, vīrusiem): priekšzāļu aktivācija notiek tieši audzēja audos, kas ļauj izvairīties no sistēmiskas toksicitātes (transgēnu ekspresija veicina tikai vēža šūnu iznīcināšana). Papildu pozitīva kvalitāte ir autologo SC "priviliģētais" stāvoklis - izmantotās pašu šūnas garantē 100% saderību un paaugstina procedūras drošības līmeni. Tomēr terapijas efektivitāte ir atkarīga no pareizas ex vivo modificētā gēna pārnešana uz SC un sekojoša transducēto šūnu pārvietošana pacienta ķermenī. Turklāt pirms terapijas pielietošanas plašā mērogā ir nepieciešams detalizēti izpētīt visus iespējamos SC transformācijas veidus vēža šūnās un izstrādāt drošības pasākumus, lai novērstu SC kancerogēnu transformāciju.

Secinājums

Rezumējot, ar pārliecību varam teikt, ka tuvojas personalizētās medicīnas laikmets, kad noteikti efektīva terapija. Jau šobrīd tiek izstrādātas individuālas ārstēšanas programmas, kas nodrošina savlaicīgu un pareizu aprūpi un ļauj būtiski uzlabot pacientu stāvokli. Evolūcijas pieejas personalizētai onkoloģijai, piemēram, genoma analīze, mērķtiecīga zāļu ražošana, vēža gēnu terapija un uz biomarķieriem balstīta molekulārā diagnostika, jau nes augļus.

Gēnu terapija ir īpaši daudzsološa metode vēža ārstēšanā. Šobrīd notiek klīniskie pētījumi, kas nereti apstiprina HT efektivitāti gadījumos, kad standarta pretvēža terapija – operācija, staru terapija un ķīmijterapija – nepalīdz. Inovatīvu HT metožu izstrāde (imūnterapija, onkolītiskā viroterapija, "pašnāvnieciskā" terapija u.c.) spēs atrisināt problēmas ar augstu mirstību no vēža, un, iespējams, nākotnē "vēža" diagnoze vairs nebūs iespējama. izklausās pēc teikuma.

Vēzis: atpazīt, novērst un novērst slimību.

Literatūra

1. Viljamss S. Klūgs, Maikls R. Kamingms. Bioloģijas un medicīnas pasaule. Ģenētikas pamati. Maskava: Technosfera, 2007. - 726 lpp.;
2. Bioinformātika: lielas datu bāzes pret lielajiem Ps;
3. Cui H., Krusa-Koreja M. un citi. (2003).

Vai jūs zināt, ka mūsu valstī ir zāles gēnu terapijai? Šīs zāles veiksmīgi ārstē izplatītu ar vecumu saistītu slimību, tās ir izturējušas klīniskos pētījumus un tiek pārdotas Krievijā kopš 2012. gada. Un pati narkotika ir vietēja, un vienīgā šāda veida, pasaulē nav analogu. Tipiska cilvēka reakcija, kas par to dzird pirmo reizi: "Nu, tā nevar būt." Tā nevar, bet tā notiek. Lai pastāstītu lasītājiem par narkotiku, ko sauc par "Neovasculgen", mēs jautājām medicīnas zinātņu kandidātam Romāns Vadimovičs Dejevs, zinātnes direktors.

Ideja un realizācija

Ideja par plazmīdu gēnu konstrukciju izmantošanu, lai izraisītu asinsvadu augšanu terapeitiskos nolūkos, noteikti nepieder Cilvēka cilmes šūnu institūtam. Izdevuma vēsture aizsākās vismaz divas desmitgades — pionieri šeit bija Dr. Jeffrey Isner un līdzautori (ASV), kuri veica izmēģinājuma pētījumu, vispirms ar vienu pacientu, pēc tam ar trim, un rezultātus publicēja vidū. -90. gadi. Šajā ziņā mēs sekojām viņu pēdās, bet konkrētā narkotiku pamatā esošā attīstība ir krievu valoda. Asinsvadu augšanas faktora gēnu saturošo plazmīdas konstrukciju 2007. gadā izveidoja un patentēja divi speciālisti: bioloģijas zinātņu doktore, profesore S.L.Vavilova) un bioloģijas zinātņu doktore profesore A.V.Itkesa (Krievijas Tautu draudzības universitāte).

Taču ne katra ideja, lai cik skaista un teorētiski pareiza būtu, tiek īstenota praksē. Pirmkārt, tas attiecas uz medicīnu, nozari, kas noteikti ir konservatīva, kur vienmēr aktuāls ir apgalvojums “labākais ir labā ienaidnieks”. Pirmais jautājums, ko sev uzdevām pirms darba uzsākšanas, bija: vai ir kāda neatrisināta problēma, ko var atrisināt ar šo plazmīdu? Kur tas var būt vajadzīgs un vai vispār vajag?

Asinsvadu ateroskleroze ir artēriju lūmena sašaurināšanās holesterīna un citu vielu nogulsnēšanās dēļ, kas var izraisīt išēmiju – orgānu un audu asins apgādes traucējumus. Ikviens zina koronāro sirds slimību - vienu no galvenajiem nāves cēloņiem pasaulē: koronāro artēriju ateroskleroze noved pie sirds muskuļa bojājumiem, iespējamās sekas - stenokardija vai sirdslēkme. Bet mēs negribējām sākt savu pētījumu ar koronāro sirds slimību. Ķirurgi aktīvi un diezgan veiksmīgi risina šo problēmu, ir daudz dažādu grupu farmaceitisko līdzekļu, kas atbalsta miokardu. Protams, par uzvaru pār infarktu vēl nav jārunā, un tomēr šī nav joma, kur jaunas zāles tiktu uzņemts ar entuziasmu.

Mēs sākām domāt par to, kādām citām išēmiskām slimībām ir nozīmīga sociāla nozīme, un atcerējāmies katram medicīnas studentam pazīstamo terminu: “intermitējoša klucī” ir apakšējo ekstremitāšu asinsvadu išēmijas simptoms. Vazokonstrikcija neļauj asinīm nokļūt muskuļos - kāju āda kļūst sausa, pēdas kļūst aukstas, pēc ilgas pastaigas sākas sāpes kājās, liekot cilvēkam apstāties un atpūsties. Šķiet, ka tas nav biedējoši, taču šī problēma ir ne mazāk nozīmīga kā miokarda išēmija. Un varbūt pat vairāk, jo diagnostikas rīku izstrādātāji, farmācijas uzņēmumi un sociālās iestādes tam pievērš daudz mazāku uzmanību. Tikmēr sāpes pēc ilgas pastaigas ir tikai sākums. Išēmija neizbēgami progresēs, attālums bez sāpēm samazināsies no kilometra (kas jau tiek uzskatīts par slimības klīnisko stadiju) līdz 200 m vai mazāk, tad sāksies sāpes miera stāvoklī un pēc tam čūlaino-nekrotiskās izmaiņas audos un, nākotne, amputācija gangrēnas dēļ.

Šodien ārsti runā par aterosklerozes pandēmiju, un šī pandēmija nav apieta Krieviju. Šīs slimības riska faktori ir labi zināmi: smēķēšana un alkohols, fizisko aktivitāšu trūkums, nesabalansēts uzturs, stress. Risks ir lielāks hipertensijas pacientiem, cilvēkiem ar lieko svaru, kuriem ir cukura diabēts, tiem, kuriem ir paaugstināts holesterīna un īpašu lipoproteīnu līmenis asinīs. Pastāv iedzimta nosliece uz aterosklerozi: par to runā, ja pacientam ir vīriešu kārtas asinsradinieki, kuri miruši no sirdslēkmes vai insulta pirms 55 gadu vecuma, bet sievietes līdz 65 gadu vecumam. Vīrieši ir vairāk pakļauti aterosklerozei agrīnā stadijā nekā sievietes, un visiem risks palielinās līdz ar vecumu.

Hroniska apakšējo ekstremitāšu išēmija (CLLI) skar aptuveni divsimt miljonus cilvēku visā pasaulē. Ir statistika par šo slimību ASV, Eiropā un Dienvidaustrumāzijā. Ir pieejami arī dati par Krieviju, taču ļoti aptuveni. Papildus problēmām ar informācijas vākšanu, apstrādi un izplatīšanu pastāv arī objektīvas grūtības. Piemēram, miokarda infarkts visos statistikas pārskatos ir ierakstīts atsevišķā rindā, gadījumu skaitīšana ir vienkārša. Bet kā ņemt vērā HINK? Agrīnā stadijā pacienti bieži nemeklē medicīnisko palīdzību. Ja ņem vērā novēlotus gadījumus, ar nekrozi un amputācijām, ne vienmēr ir iespējams nodalīt tos gadījumus, kad amputācijas cēlonis bija, piemēram, diabēts vai trauma. Vispārīgi runājot, šī statistikas sadaļa ir diezgan skumja. Tiek lēsts, ka Amerikas Savienotajās Valstīs vien katru gadu tiek veiktas aptuveni 150 000 amputāciju. Mūsu valstī, pēc ārstu ekspertu domām, tas ir no 45 000 līdz 150 000 gadā, ņemot vērā veselības aprūpes stāvokli un rūpes par savu veselību kultūru.

Saskaņā ar aptuveniem datiem katru gadu Krievijā aptuveni 300 tūkstošiem cilvēku tiek diagnosticēta hroniska apakšējo ekstremitāšu išēmija. Parasti tie ir cilvēki vecumā no 55 līdz 60 gadiem, bet ir arī agrīni gadījumi. Mēs uzskatām, ka valstī ar šo slimību dzīvo no miljona līdz diviem miljoniem cilvēku. Prognoze viņiem ir nelabvēlīga. Ja runājam par smagāko stadiju, trešo un ceturto (sāpes miera stāvoklī un nekroze), tad gada laikā pēc diagnozes noteikšanas aptuveni ceturtā daļa no viņiem mirst aterosklerozes progresēšanas dēļ, tostarp citos anatomiskajos reģionos; ceturtā daļa izdzīvo amputāciju, ceturtdaļā progresē kāju asinsvadu bojājumi un tikai ceturtdaļā mūsdienu medicīna var panākt vismaz zināmu stabilizāciju.

Tā pati plazmīda

Ko šādiem cilvēkiem var dot asinsvadu ķirurģija? Vienkāršākais variants ir mehāniski salabot asinsvadus: nomainiet problēmzonu ar protēzi vai izveidojiet ceļu asinsrites apvadīšanai. Bet vispirms apmēram ceturtdaļā pacientu anatomiskā struktūra kuģi ir tādi, ka nav iespējams veikt ķirurģisku rekonstrukciju. Otrkārt, ateroskleroze ne vienmēr skar lielus asinsvadus - tās var būt arī artērijas zem spraugas. ceļa locītava, apakšstilbā. Asinsvadu diametrs tur ir neliels, un pastāv liela varbūtība, ka ķirurģiskā operācija nedos vēlamo rezultātu šunta trombozes, endotēlija proliferācijas u.c. dēļ.. Speciālisti atklāti atzīst, ka asinsvadu ķirurģija visas problēmas šajā jomā neatrisina.

Ja operācija neizdodas, zāles paliek. Bet arī farmakoloģija nepiedāvā brīnumlīdzekļus. Standarta terapija šādiem pacientiem ietver tādu zāļu iecelšanu, kas uzlabo asins reoloģiskās īpašības, atslābina asinsvadu sieniņu tonusu. Kad išēmija kļūst kritiska, tā pāriet no otrās pakāpes uz trešo un pēc tam uz ceturto, tiek pievienotas prostaglandīnu grupas zāles, kas paplašina mazos asinsvadus. Tur asinis “krīt cauri”, uzlabojas audu asins apgāde un tiek novērsts vissliktākais. Bet ik pēc sešiem mēnešiem šī terapija ir jāatkārto - līdz trauki reaģē uz prostaglandīniem.

Turklāt Cilostazols ir reģistrēts Eiropā un ASV. Lai gan tā darbības mehānisms nav pilnībā skaidrs, ir pierādīts, ka tas uzlabo perifēro asins plūsmu. Cilostazolu ieteicams lietot Eiropā un ASV, taču mums ir savdabīga situācija: zāles ir minētas Nacionālajās vadlīnijās pacientu ar perifēro artēriju slimību ārstēšanai, bet vēl nav apstiprinātas lietošanai Krievijas Federācijā. Turklāt Eiropas Zāļu aģentūra 2013. gada martā izdeva paziņojumu presei, kurā tika runāts par cilostazola blakusparādībām, kas saistītas ar sirds disfunkciju. Tagad par kontrindikāciju lietošanai tiek uzskatīta hroniska sirds mazspēja. Un tas ievērojami ierobežo tā lietošanu pacientiem ar apakšējo ekstremitāšu išēmiju: starp tiem ir daudz siržu, ateroskleroze ir sistēmiska parādība.

Apsverot šo situāciju, mēs nolēmām, ka darbība, ko izstrādātāji pieņēma plazmīdas konstrukcijai ar VEGF gēnu, ir angioģenēze, radīšana. de novo mikroasinsvadu trauki, - var būt noderīgi. Protams, mēs neizteicām pretenciozus paziņojumus par uzvaru pār išēmiju. Mūsu zāles neārstē aterosklerozi, bet atjauno asinsriti vietās, kur tā ir traucēta, un ļauj asinīm nokļūt šūnās un audos, kuros trūkst skābekļa un barības vielu.

Medicīnas sabiedrība, kā jau minēju, ir diezgan konservatīva, jo īpaši ķirurģijas aprindās. Sapratām, ka par savu taisnību būs jācīnās. Neovasculgen reģistrēts 2011. gadā, un kopš tā laika veicam skaidrojošo darbu - ceļojam pa valsti, rīkojam konferences un simpozijus, komunicējam ar ārstiem, stāstām par zālēm, kaut ko labojam savās idejās, ņemot vērā apgūto. no viņiem. Principā tagad sākas interesantākais. Aiz muguras ir klīniskie pētījumi, kas ir apstiprinājuši zāļu drošību un efektivitāti ievērojamai daļai pacientu. Rezultāti runāja paši par sevi (par tiem nedaudz vēlāk), ekspertiem tie bija pārliecinoši, un ekspertu viedoklis pārliecināja amatpersonas. Kļuva skaidrs, ka angiogēnā terapija kā neatkarīgs elements kompleksa ārstēšana ir tiesības eksistēt, un sākās smalks, gandrīz rotaslietas darbs - zāļu pielāgošana konkrētām klīniskām situācijām: bija jāsaprot, kam tās ir indicētas vispār, kad tās jāparaksta kombinācijā ar ķirurģisku rekonstrukciju, ar zāles no citām farmakoloģiskām grupām.

Mūsdienās pasaulē klīniskai lietošanai ir atļauti tikai pieci gēnu preparāti: trīs ļaundabīgo audzēju ārstēšanai, ceturtais retas iedzimtas slimības - lipoproteīna lipāzes deficīta un mūsu neovaskulgēns. Jāsaprot, ka gēnu terapija ir atšķirīga. Iedzimtu slimību ārstēšana ietver spēcīgu ilgstošu genoma traucējumu korekciju. Tā darbojas glibera un citas tai līdzīgas zāles, kas vēl nav nonākušas tirgū, bet, iespējams, drīz parādīsies. Mums ir nepieciešama tikai īslaicīga angiogēzes indukcija – mūsu ģenētiskā konstrukcija šūnās darbojas no vienas dienas līdz 10-14 dienām, uzsāk asinsvadu augšanas procesu un tad pazūd. Protams, nav vajadzības runāt par jebkādu "iejaukšanos genomā".

Tāpēc zāles tiek ievadītas lokāli tajās vietās, kur nepieciešams audzēt jaunus traukus. Ārzemēs viņi mēģināja injicēt līdzīgas konstrukcijas intravenozi un intraarteriāli, taču tam nebija jēgas: saskaroties ar asinīm, zāles ātri sabruka. Tas ir labi, jo nodrošina drošību: plazmīda nevar nokļūt citās attālās ķermeņa daļās un nesāks angioģenēzes procesu tur, kur tas ir nevēlams.

Kas attiecas uz gēnu terapijas zālēm hroniskas apakšējo ekstremitāšu išēmijas ārstēšanai, tad pagaidām tirgū ir tikai neovaskulgēns, bet pēc kāda laika var parādīties arī citi. Uzņēmums Sanofi-Aventis, kas sponsorēja klīniskos pētījumus par plazmīdu konstrukciju ar fibroblastu augšanas faktora gēnu, ir atstājis sacensību. Fibroblasti ir iesaistīti asinsvada nobriešanā – tie pulcējas ap endotēlija kanāliņu un veido spēcīgu sienu, taču tas vairs nav procesa aizsākums, bet gan nākamais posms. Sākt ar fibroblastu palielināšanu bija riskanta ideja, un tā neizdevās. Taču pasaulē šajā jomā tiek veikti vēl vismaz ducis pētījumu, daži no tiem ir pārcēlušies no klīnisko pētījumu otrās fāzes uz trešo. Diezgan veiksmīgi japāņu zinātnieki pabeidza savu narkotiku izpēti. Šī ir plazmīda, kas ir līdzīga mūsējai, taču tā izmanto hepatocītu augšanas faktora gēnu HGF kā terapeitisko faktoru (hepatocīti ir aknu šūnas, bet šajā gadījumā šis proteīns, neskatoties uz nosaukumu, stimulē tā paša asinsvadu endotēlija augšanu). Japānā viņi veiksmīgi pabeidza trešo posmu, taču nesāka reģistrēt, ražot un pārdot zāles, viņi atrada investīcijas, lai organizētu klīniskos pētījumus ASV un kļūtu globāls, nevis neliels vietējais tirgus.

Kā tas strādā

Neovasculgen aktīvā viela ir plazmīda, tas ir, DNS molekula, kas noslēgta gredzenā. To ražo ar biotehnoloģisko metodi: Escherichia coli šūnas Escherichia coli dzīvojot bioreaktorā, daudzkārt kopē plazmīdu, tad to izolē un attīra. Plazmīda satur cilvēka gēnu vegf, kas kodē proteīnu – asinsvadu endotēlija augšanas faktoru (VEGF – asinsvadu endotēlija augšanas faktors; endotēlijs šeit ir asinsvadu odere, to iekšējais slānis). Šim proteīnam ir vairākas izoformas, šajā gadījumā tiek izmantota VEGF165, kas sastāv no 165 aminoskābēm. Ir pierādīts, ka šis proteīns visspēcīgāk stimulē asinsvadu šūnu dalīšanos.

Zāles tiek ievadītas pacientam sāpošā kājā ar vairākām injekcijām. Plazmīda iekļūst išēmisko audu šūnās, kuras sāk sintezēt proteīnu atbilstoši gēna shēmai. Ne visa DNS nonāks šūnu iekšienē, taču bažām nav pamata: šīs plazmīdas dzīves ilgums organismā ārpus šūnas ir desmitiem minūšu, tad to iznīcinās fermenti, lai ģenētiskā konstrukcija nenokļūtu. citos orgānos un audos, tā darbība būs tikai lokāla.

Šūnas sāk sintezēt un izdalīt VEGF165. Tas iekļūst asinsvadu gultnē un saistās ar endotēlija šūnu receptoriem. Šī ir komanda: "Mēs šeit sākam audzēt jaunu trauku." Šūnas aktīvi dalās, migrē uz išēmiskajiem audiem un sāk veidot jaunu asinsvadu kanāliņu, asinsvadu. Tas ir ne mazāk sarežģīts process kā jauna ceļa būvniecība: ir jāorganizē izeja no galvenās šosejas, jāatbrīvo maršruts, tas ir, kuģa ceļā jāizšķīdina blīvi audi. Protams, kanāliņa, kas sastāv no endotēlija šūnām, arī no ārpuses ir jāapģērbj ar muskuļu slāni un šķiedrām. saistaudi. Rezultātā tiek atjaunota asinsrite, audi atkal tiek pilnībā apgādāti ar skābekli un barības vielām – atkāpjas išēmija.

rezultātus

Mūsu zāles ir izturējušas visus klīnisko pētījumu posmus. Krievijas normatīvajos dokumentos tās netiek sauktas par "trīs fāzēm", bet nozīme no tā nemainās: pirmais posms ir drošības novērtējums, otrais posms ir dozēšanas režīma noteikšana, biežākās blakusparādības, pirmais posms. dati par efektivitāti, un trešais ir precīza efektivitātes noteikšana un retāk sastopamas blakusparādības un komplikācijas. Trīs organizācijas, kurās tika veikti klīniskie pētījumi, ir Krievijas zinātnes centrs B. V. Petrovska vārdā nosauktā ķirurģija, Rjazaņas Valsts medicīnas universitāte un Jaroslavļas reģionālā klīniskā slimnīca.

Pirmajā posmā parasti tiek piesaistīti veseli brīvprātīgie jaunieši. Tomēr mūsu gadījumā tas būtu neētiski, jo mēs joprojām runājām par gēnu terapiju. Šajā jautājumā mums bija pilnīga vienošanās ar regulējošās iestādes pārstāvjiem (toreiz, 2009. gadā, tas bija Federālais veselības aprūpes uzraudzības dienests, bet tagad zāļu reģistrācijas funkcija ir nodota tieši Veselības ministrijai): vesels. cilvēkiem nevajadzētu injicēt gēnu konstrukciju, ir nepieciešams apvienot pirmo posmu ar otrā sākumu un veikt drošības novērtējumu jau pacientiem. Šajā lēmumā nebija nekā neparasta: visā pasaulē spēcīgas zāles, piemēram, psihiatrijā lietotās, netiek pārbaudītas uz veseliem brīvprātīgajiem.

Zāles tika pārbaudītas CINC otrajā un trešajā posmā saskaņā ar vispārpieņemto A. V. Pokrovska-Fonteina klasifikāciju. 2.a stadija – pacients var noiet apmēram kilometru, un tad sākas sāpes. Jau šajā posmā muskuļu šķiedru metabolismā notiek neatgriezeniskas izmaiņas. 2.b stadija - nesāpīgs attālums 200 metri vai mazāk, un trešais posms, kad jau runā par apakšējo ekstremitāšu kritisko išēmiju - sāpes miera stāvoklī, sēdus un guļus stāvoklī. Tajos pašos posmos tagad ir indicēta neovaskulgēna lietošana - tas ir, gandrīz visos gadījumos, izņemot pirmo, asimptomātisku, kad pacients pat nezina, ka viņš ir slims, un ceturto, nekrotisku, kad rodas čūlas un gangrēna forma. Tomēr bija gadījumi, kad ārsti izrakstīja zāles ceturtajā stadijā kā izmisuma terapiju, pieverot acis uz norādījumiem. Jo efekts pārsniedza mūsu optimistiskākos pieņēmumus.

Ārsti, kas piedalījās klīniskajos pētījumos, parasti tos sāka ar lielu skepsi. Ļoti pieredzējis ķirurgs, kurš redzējis desmitiem, ja ne simtiem smagu pacientu, lieliski atspoguļojot visas terapijas un prognozes iespējas, tiek piedāvāts pacientam veikt dažas inovatīvas injekcijas - reakciju nav grūti iedomāties. Un tad paiet divas nedēļas, atskan zvans, un ārsts saka: "Mans pacients atstāja kruķus un pats uzkāpj uz trešo stāvu." Šāds stāsts notika Rostovā pie Donas, kur viņi pārbaudīja zāļu efektivitāti medicīnas zinātņu doktora, Rostovas Valsts medicīnas universitātes profesora Ivana Ivanoviča Kateļņicka vadībā. Tagad mēs esam reģistrējuši šo medikamentu Ukrainā, kur ārsti to sastapuši ar ne mazāku un, iespējams, pat lielāku neuzticību nekā viņu Krievijas kolēģi. Nesen es saņēmu e-pastu no viena no viņiem ar virsrakstu: "Šī ir bumba!" - tāpēc viņš bija pārsteigts par rezultātu.

Uzreiz atzīmēju, ka brīnumaini stāsti diemžēl nenotiek ar katru pacientu. Tāpat kā ar citām zālēm, ir arī pacientu kategorija, kuri nereaģē uz neovaskulgēno terapiju. Mēs cenšamies noskaidrot, kāpēc tas notiek un ko šeit var labot. Turklāt ne visi pacienti slimo tikai ar aterosklerozi: kādam tā ir uz cukura diabēta fona vai kādam attīstās tromboangīts (Burgera slimība), un tas, protams, pasliktina rezultātu. Apmēram 15% pacientu nereaģē uz ārstēšanu tā, kā mēs vēlētos – ļoti, ļoti maz. Tomēr ir vērojama nepārprotama pozitīva tendence, un var pat atzīmēt, ka jo smagāka ir išēmija, jo izteiktāks ir klīniskais efekts. Dažus pacientus piemeklējam divus vai trīs gadus. Kolēģi no Jaroslavļas (I. N. Staroverovs, Ju. V. Červjakovs) apkopoja statistiku par četriem gadiem - redzam, ka pacients, kurš gandrīz nevarēja noiet 50 metrus, divu gadu laikā dodas garās pastaigās, bezsāpju attālums ir pieaudzis līdz plkst. trīs kilometri. Agrīnā stadijā bija ievērojams gadījums: pacients, kaislīgs mednieks, nebija apmierināts ar sāpēm kājās pēc pirmā kilometra, un viņš pats iegādājās zāles. Tagad šis vīrietis medī alni, ātrā tempā soļojot daudzus kilometrus.

Klīniskā pētījuma ietvaros pacienti aizpildīja anketas, lai novērtētu dzīves kvalitātes izmaiņas. Bija vairākas skalas, kas sastāvēja no diviem komponentiem: fiziskā veselība un psiholoģiskā labklājība. Izrādījās, ka fiziskā sastāvdaļa uzlabojas ar ļoti labu uzticamību, to var redzēt piemērā ar tādu pašu attālumu bez sāpēm. Bet psiholoģiskie uzlabojumi, lai gan tika atzīmēti, nesasniedza statistiski nozīmīgu atšķirību. Varbūt tā ir tā, ka pēc ilgas pastaigas kājas tomēr sāk sāpēt, bet es gribu, lai nesāp nemaz, vai varbūt cilvēkiem ir grūti noticēt labajam pēc smagas slimības un drūmām izredzēm, vai krievu mentalitātei. , par kuru ir tik daudz, ir vainīgs.saka. Būtu interesanti salīdzināt rezultātus šim rādītājam citās valstīs.

Emisijas cena

Cik maksā zāles, cik maksās ārstēšana? Diemžēl zāles ir dārgas. Rakstā nav jēgas norādīt precīzas cenas, to ir vieglāk meklēt internetā, taču jums ir jāpieskaņojas apmēram simts tūkstošu rubļu apjomā par iepakojumu. Ja ņemam vērā, ka prostaglandīnu kurss vidēji maksā apmēram 40 tūkstošus rubļu un ir jāatkārto ik pēc sešiem mēnešiem, un neovaskulgēna iedarbība saglabājas un pat palielinās vismaz divus līdz trīs gadus, tad aina nav tāda. pesimistisks. Bet kāpēc tas ir tik dārgi?

Lūk, ko par to saka mūsu izpilddirektors, šīs jomas tiešais vadītājs A. A. Isajevs: “Neovasculgen ir pirmais medikaments savā klasē, kas nozīmē lielas investīcijas: gadiem ilgi pētījumi, grūts darbs ar regulatoriem un ārstiem, milzīgas pūles, lai radītu ražošanu. laišanai tirgū. Un iznākums ir neliels zāļu devu daudzums, līdz tā lietošana kļūst par plaši izplatītu praksi. Līdz ar to oriģinālo izstrādņu augstā cena salīdzinājumā ar to kopijām un tā sauktajām ģenēriskajām zālēm. Cena, unikalitāte un plašs pielietojums ir cieši saistīti. Tāpēc mūsu uzdevums ir ne tikai izstrādāt medikamentu, bet arī padarīt to pieejamu ikvienam. Mēs pie tā smagi strādājam."

No mūsu viedokļa vēlamā notikumu gaita ir neovaskulgēna iekļaušana to zāļu sarakstā, kuras var iegādāties par federālā vai reģionālā budžeta līdzekļiem un nodrošināt pacientiem, kuriem nepieciešama šāda ārstēšana. Šāds lēmums ir ekonomiski pamatots: dīvainā kārtā pacients ar vienu kāju vai bez kājām valstij par katru cenu maksā vairāk nekā pērkot zāles, kas ļaus izvairīties no amputācijas. Zināmu cerību dod arī tas, ka neovaskulgēns oficiāli ir "inovatīvs medikaments", proti, iekļauts attiecīgajos sarakstos kā prioritārs un pelnījis valsts atbalstu.

Ir skaidrs, ka neovasculgen izmaksas nevar būt ļoti zemas. audzēšana E. coli bioreaktorā, manipulācijas ar to, plazmīdas izolēšana un attīrīšana, sagatavošana zāļu forma, kvalitātes kontrole - tas viss ir kvalificēta personāla darbs, dārgi instrumenti un reaģenti. Bet interesanti, ka tikai ražošanas daļas izmaksas Krievijā ir aptuveni astoņas reizes lielākas nekā tad, ja to pašu darītu, teiksim, Izraēlā. Iemesls ir vienkāršs: gan aprīkojums, gan palīgmateriāli tiek importēti, kas palielina izmaksas. Turklāt pamazām ir jāatpelna investīcijas klīniskajos pētījumos, ārstu apmācībā. Mūsu izplatītājam, uzņēmumam Sotex, ir savas intereses - tas ir viens no uzņēmumiem, kas ietilpst farmācijas tirgū labi pazīstamajā Protek grupā. Arī viņu darbs ir vajadzīgs, tieši viņi piegādā zāles reģioniem, lai tās būtu pieejamas vairāk nekā vienam lielpilsētas iedzīvotājam.

Mēs no savas puses darām visu iespējamo, lai zāles apstiprinātu savu efektivitāti plašās lietošanas gaitā - ik mēnesi rīkojam izbraukuma pasākumus, sanāksmes, apaļā galda sarunas, sazināmies ar ārstiem, atbildam uz jautājumiem. Skatoties Krievijas Federācijas kartē, jau varu nosaukt asinsvadu ķirurģijas speciālistus katrā reģionā. Nevarētu teikt, ka šī bija vienprātības parāde – katram praktizējošam ārstam ir sava pieredze un sava attieksme pret indikācijām un kontrindikācijām. Bet viņi zina par narkotiku, to lieto, un tas mums ir galvenais. Kad ir rezultāti un tie ir pārliecinoši konkrētā reģiona ekspertu kopienai, ar amatpersonām jau ir vieglāk runāt. Ja viss izdosies, drīz asinsvadu ķirurgu arsenālā parādīsies jauns noderīgs rīks.

Veselība

Ideja par defektīvu gēnu aizstāšanu ar veseliem, kas sāka aktīvi iegūt zinātnisku čaulu pagājušā gadsimta deviņdesmito gadu sākumāšķita, ka tas deva cerību bezcerīgākajiem pacientiem. Tomēr kopš pirmā gēnu terapijas eksperimenta, kas tika veikts 1990. gadā, zinātnieku optimisms ir nedaudz mazinājies - un tas viss ir saistīts ar zināmām neveiksmēm un grūtībām gēnu terapijas metožu ieviešanā. Taču gēnu terapijas piedāvātās iespējas Parkinsona slimības, cistiskās fibrozes ārstēšanai, dažāda veida vēzis un daudzas citas slimības ir patiesi neierobežotas. Tāpēc zinātnieki nenogurstoši strādā cenšoties pārvarēt visas grūtības, kas rodas viņu ceļā saistībā ar gēnu terapiju.

Kas ir gēnu terapija?

Tātad, kas īsti ir gēnu terapija? Lai atbildētu uz šo jautājumu, tas ir jāatgādina galvenā gēnu funkcija mūsu organismā ir regulēt olbaltumvielu ražošanu nepieciešami visu šūnu normālai darbībai un veselībai. Bet daži ģenētiski defekti (gēnu defekti) vienā vai otrā pakāpē traucē to galveno funkciju, novēršot olbaltumvielu ražošanu. Gēnu terapijas (gēnu terapijas) mērķis ir bojātu gēnu aizstāšana ar veseliem. Tas palīdzēs izveidot atbilstošā proteīna reprodukciju, kas nozīmē, ka cilvēks tiks izārstēts no noteiktas slimības.

Ņemot vērā ideālo attīstības scenāriju, šūnas ar pielāgotas dezoksiribonukleīnskābes (DNS) molekulas sāks dalīties, veidojot, savukārt, vairākas koriģētā gēna kopijas, kas ļaus organismam atbrīvoties no ģenētiskās anomālijas un pilnībā atveseļoties. Tomēr veselīgu gēnu ievadīšana slimajās šūnās (kā arī mēģinājumi koriģēt atbilstošās novirzes) ir ārkārtīgi sarežģīts process, kas līdz šim ir bijis reti veiksmīgs.. Tāpēc lielākā daļa mūsdienu pētījumu ir vērsti uz drošu un uzticamu mehānismu izstrādi gēnu ievadīšanai bojātās šūnās.

Gēnu terapijas veidi: ex vivo un in vivo terapija

Atkarībā no DNS ievadīšanas pacienta genomā metodes var veikt gēnu terapiju vai nu šūnu kultūrā (ex vivo), vai tieši organismā (in vivo). Ex vivo gēnu terapijas gadījumā šūnas tiek izņemtas no pacienta ķermeņa, ģenētiski modificētas un pēc tam atkal ievadītas indivīda ķermenī. Šī metode ir īpaši noderīga asins slimību ārstēšanā, jo asins šūnas var diezgan viegli noņemt un ievietot atpakaļ. Tomēr vairuma citu slimību gadījumā šūnu izņemšana no ķermeņa un to ievietošana atpakaļ nav vienkārša. Piemēram, sirds slimību gadījumā ģenētisku iemeslu dēļ, efektīvs pasākums ir tā sauktā in vivo gēnu terapija, kad gēnu izmaiņas tiek veiktas tieši pacienta organismā. Lai veiktu šo procedūru, ģenētiskā informācija tiek nogādāta tieši šūnā, izmantojot vektoru - nukleīnskābes molekulu, izmanto gēnu inženierijā ģenētiskā materiāla pārnesei. Vairumā gadījumu, lai veiktu šo pārraidi, pētnieki izmanto vīrusus, kas nav bīstami veselībai un dzīvībai.

Metodes ģenētiskās informācijas nogādāšanai šūnā

Daudzi pētījumi liecina, ka dažādu vīrusu izmantošana ir ļoti efektīvs risinājums, kas ļauj iziet cauri organisma imūnās aizsardzības spēkiem un pēc tam inficē šūnas, izmantojot tās vīrusa izplatīšanai. Lai veiktu šo procedūru, gēnu inženieri izvēlējās piemērotākos vīrusus no retrovīrusu un adenovīrusu grupas. Retrovīrusi sniedz ģenētisko informāciju ribonukleīnskābes (RNS) veidā – DNS līdzīgas molekulas veidā, kas palīdz apstrādāt DNS glabāto ģenētisko informāciju. Tiklīdz ir iespējams dziļi iekļūt tā sauktajā mērķa šūnā, no RNS molekulas tiek iegūta DNS molekulas kopija. Šo procesu sauc par reverso transkripciju. Kad šūnai ir pievienota jauna DNS molekula, visas jaunās šūnas kopijas saturēs šo modificēto gēnu.

Adenovīrusi nekavējoties pārnēsā ģenētisko informāciju DNS veidā, kas tiek nogādāta šūnā, kas nedalās. Lai gan šie vīrusi piegādā DNS tieši mērķa šūnas kodolā DNS neiekļaujas šūnas genomā. Tādējādi modificētais gēns un ģenētiskā informācija netiek nodota meitas šūnām. Gēnu terapijas priekšrocība, ko veic, izmantojot adenovīrusus, ir iespēja ievadīt gēnus nervu sistēmas šūnās un gļotādā. elpceļi, atkal, izmantojot vektoru. Turklāt ir arī trešā gēnu terapijas metode, ko veic ar tā sauktajiem adeno-asociētajiem vīrusiem. Šie vīrusi satur salīdzinoši neliels ģenētiskās informācijas apjoms, un tos ir daudz grūtāk novērst nekā retrovīrusus un adenovīrusus. Tomēr ar adeno saistītu vīrusu priekšrocība ir tāda, ka tie neizraisa cilvēka imūnsistēmas reakciju.

Grūtības, izmantojot vīrusus gēnu terapijā

Galvenā problēma, kas saistīta ar ģenētiskās informācijas ievadīšanas metodi šūnā ar vīrusu palīdzību, ir tā ir ārkārtīgi grūti pilnībā kontrolēt gēnu savienojumu ar mērķa šūnu. Tas var būt ārkārtīgi bīstami, jo nav izslēgta tā sauktā gēnu ekspresija, kas var pārvērst veselas šūnas vēža šūnās. Šobrīd šī problēma ir īpaši aktuāla cīņā pret retrovīrusiem. Otra problēma kuru risinājumu vēl nav iespējams organizēt, slēpjas apstāklī, ka ar vienu gēnu terapijas izmantošanas procedūru, visbiežāk, nepietiek. Lielākajai daļai ģenētisko terapiju laiku pa laikam ir jāatkārto. Un, treškārt, vīrusu izmantošanu ģenētiskās informācijas nogādāšanai šūnā sarežģī organisma imūnsistēmas reakcijas risks. Tā ir arī ārkārtīgi nopietna problēma, īpaši gadījumos, kad kad nepieciešama atkārtota gēnu terapijas procedūras atkārtošana, jo pacienta ķermenis pamazām pielāgojas un sāk arvien efektīvāk cīnīties ar ievadītajiem vīrusiem.

Gēnu terapija: pētījumi turpinās

Ja mēs runājam par panākumiem, tad šajā brīdī ģenētiskā terapija ir ārkārtīgi efektīvs pasākums. tā sauktā kombinētā imūndeficīta ārstēšanā, kas saistīts ar X hromosomas gēnu. No otras puses, ir ļoti maz gadījumu, kad gēnu terapija veiksmīgi tiek izmantota šīs slimības ārstēšanā. Turklāt pati ārstēšana ir riskants pasākums, jo tā var izraisīt vairākus simptomus pacientiem, kas ir sastopami cilvēkiem, kuri cieš no leikēmijas. Neatkarīgi no šī slimība, ir ļoti, ļoti maz gadījumu, kad tiek izmantota gēnu terapija, kas būtu tikpat efektīva, lai gan jaunākie pētījumi ļauj cerēt uz agrīnu gēnu terapijas izmantošanu lai ārstētu pacientus, kuri cieš no artrīta, smadzeņu vēža, sirpjveida šūnu anēmijas, tīklenes plaisas un dažiem citiem stāvokļiem.

Izrādās, ka apmēram praktisks pielietojums Par gēnu terapiju medicīnā vēl ir ļoti agri runāt. tomēr pētnieki turpina meklēt veidus, kā droši un efektīvi izmantot gēnu terapiju, veicot lielāko daļu eksperimentu ar dzīviem audiem, kas pārnesti no ķermeņa uz mākslīgu ārējo vidi. Starp šiem eksperimentiem ārkārtīgi interesanti ir pētījumi, kuros zinātnieki mēģina mērķa šūnā ievadīt mākslīgu, 47. hromosomu. Jaunākie zinātniskie atklājumi ir ļāvuši zinātniekiem labāk izprast procesus kas rodas RNS molekulas ievadīšanas laikā. Tas ir novedis pie mehānisma izstrādes gēnu transkripcijas nomākšanai (tā sauktais gēnu nokauts), kas var būt noderīgs Hamiltona slimības ārstēšanā. Zinātnieki arī ziņo, ka viņiem ir izdevies izstrādāt veidu, kā smadzeņu šūnām piegādāt ģenētisko informāciju, ko iepriekš nevarēja izdarīt, izmantojot vektoru, jo šī molekula šim nolūkam bija pārāk liela. Citiem vārdiem sakot, pētījumi turpinās, kas nozīmē, ka cilvēcei ir visas iespējas iemācīties cīnīties ar slimībām, izmantojot gēnu terapijas metodes.

Ievads

Katru gadu zinātniskajos žurnālos parādās arvien vairāk rakstu par medicīnu klīniskie pētījumi, kurā tā vai citādi tika izmantota uz dažādu gēnu ievadīšanu balstīta ārstēšana - gēnu terapija. Šis virziens ir izaudzis no tādām labi attīstītām bioloģijas nozarēm kā molekulārā ģenētika un biotehnoloģija.

Bieži vien, kad jau ir izmēģinātas konvencionālās (konservatīvās) metodes, tieši gēnu terapija var palīdzēt pacientiem izdzīvot un pat pilnībā atveseļoties. Piemēram, tas attiecas uz iedzimtām monogēnām slimībām, tas ir, tām, ko izraisa viena gēna defekts, kā arī daudzām citām. Vai, piemēram, gēnu terapija var palīdzēt un glābt ekstremitāti tiem pacientiem, kuriem ir sašaurināts asinsvadu lūmenis. apakšējās ekstremitātes un rezultātā ir izveidojusies noturīga apkārtējo audu išēmija, tas ir, šiem audiem ir liels deficīts barības vielas un skābeklis, ko parasti ar asinīm pārnes visā ķermenī. Bieži vien šādus pacientus nav iespējams ārstēt ar ķirurģiskām manipulācijām un medikamentiem, bet, ja šūnas lokāli būtu spiestas izmest vairāk proteīna faktoru, kas ietekmētu jaunu asinsvadu veidošanās un dīgšanas procesu, tad išēmija kļūtu daudz mazāk izteikta un kļūtu. pacientiem ir daudz vieglāk dzīvot.

gēnu terapija mūsdienās to var definēt kā slimību ārstēšanu, ievadot gēnus pacientu šūnās ar mērķi novērst gēnu defektus vai piešķirt šūnām jaunas funkcijas. Pirmie gēnu terapijas metožu klīniskie pētījumi tika veikti vēl nesen 1989. gada 22. maijā, lai diagnosticētu vēzi. Pirmā iedzimtā slimība, kurai tika piemērotas gēnu terapijas metodes, bija iedzimts imūndeficīts.

Ar katru gadu pieaug veiksmīgi veikto klīnisko pētījumu skaits dažādu slimību ārstēšanā, izmantojot gēnu terapiju, un līdz 2014. gada janvārim tas sasniedza 2 tūkstošus.

Tajā pašā laikā mūsdienu gēnu terapijas pētījumos jāņem vērā, ka sekas, ko rada manipulācijas ar gēniem jeb “sajaukta” (rekombinantā) DNS. in vivo(lat. burtiski "dzīvs") nav pietiekami pētīti. Valstīs ar visprogresīvāko pētījumu līmeni šajā jomā, īpaši ASV, medicīniskie protokoli, kuros izmantotas maņu DNS sekvences, ir pakļauti obligātai pārbaudei attiecīgajās komitejās un komisijās. Amerikas Savienotajās Valstīs tās ir Rekombinantās DNS padomdevēja komiteja (RAC) un Pārtikas un zāļu pārvalde (FDA) ar turpmāku obligātu projekta apstiprinājumu no Nacionālo veselības institūtu (Nacionālo veselības institūtu) direktora.

Tātad, mēs nolēmām, ka šī ārstēšana ir balstīta uz to, ka, ja dažiem ķermeņa audiem trūkst atsevišķu olbaltumvielu faktoru, tad to var labot, ievadot šajos audos atbilstošus proteīnus kodējošos gēnus, un viss kļūs vairāk vai mazāk brīnišķīgi. . Pašus proteīnus nevar injicēt, jo mūsu organisms uzreiz reaģēs ar ne vāju imūnreakciju, un darbības ilgums būtu nepietiekams. Tagad mums ir jāizlemj par gēna ievadīšanas šūnās metodi.

Transfekcija šūnas

Sākumā ir vērts ieviest dažu terminu definīcijas.

Gēnu transportēšanu veic vektors ir DNS molekula, ko izmanto kā "transportlīdzekli" ģenētiskās informācijas mākslīgai pārnešanai šūnā. Ir daudz veidu vektoru: plazmīdu, vīrusu, kā arī kosmīdus, fasīdus, mākslīgās hromosomas utt. Ir ļoti svarīgi, lai vektoriem (jo īpaši plazmīdu vektoriem) būtu raksturīgās īpašības:

1. Replikācijas izcelsme (ori)- nukleotīdu secība, kurā sākas DNS dublēšanās. Ja vektora DNS nevarēs dublēt (replicēt), tad vajadzīgais ārstnieciskais efekts netiks sasniegts, jo to vienkārši ātri atšķels intracelulārie nukleāzes enzīmi, un šablonu trūkuma dēļ galu galā veidosies daudz mazāk proteīna molekulu. Jāņem vērā, ka šie punkti ir specifiski katrai bioloģiskajai sugai, tas ir, ja vektora DNS paredzēts iegūt, to pavairojot baktēriju kultūrā (nevis tikai ar ķīmisko sintēzi, kas parasti ir daudz dārgāka), tad divi. replikācijas sākuma punkti būs nepieciešami atsevišķi - cilvēkiem un baktērijām;

2. Ierobežojumu vietnes- specifiskas īsas sekvences (parasti palindromiskas), kuras atpazīst īpaši enzīmi (restrikcijas endonukleāzes) un tās sagriež noteiktā veidā - ar "lipīgu galu" veidošanos (1. att.).

1. att. "Lipīgo galu" veidošana ar restrikcijas piedalīšanos

Šīs vietas ir nepieciešamas, lai vektora DNS (kas patiesībā ir "tukša") ar vēlamajiem terapeitiskajiem gēniem savienotu vienā molekulā. Šādu molekulu, kas ir šķērssaistīta no divām vai vairākām daļām, sauc par "rekombinanto";

3. Ir skaidrs, ka mēs vēlētos iegūt miljoniem rekombinantās DNS molekulas kopiju. Atkal, ja mums ir darīšana ar baktēriju šūnu kultūru, tad šī DNS ir jāizolē tālāk. Problēma ir tāda, ka ne visas baktērijas norīs mums nepieciešamo molekulu, dažas to nedarīs. Lai atšķirtu šīs divas grupas, tās tiek ievietotas vektora DNS selektīvie marķieri- zonas, kas ir izturīgas pret noteiktām ķīmiskām vielām; tagad, ja šīs pašas vielas pievienos videi, tad izdzīvos tikai tās, kas pret tām ir izturīgas, bet pārējās mirs.

Visas šīs trīs sastāvdaļas var novērot pašā pirmajā mākslīgi sintezētajā plazmīdā (2. att.).

2. att

Tiek saukts pats plazmīda vektora ievadīšanas process noteiktās šūnās transfekcija. Plazmīda ir diezgan īsa un parasti apļveida DNS molekula, kas atrodas baktēriju šūnas citoplazmā. Plazmīdas nav saistītas ar baktēriju hromosomu, tās var vairoties neatkarīgi no tās, baktērijas tās var izdalīt vidē vai, gluži otrādi, uzsūkties (absorbcijas process ir transformācija). Ar plazmīdu palīdzību baktērijas var apmainīties ar ģenētisko informāciju, piemēram, pārnest rezistenci pret noteiktām antibiotikām.

Plazmīdas pastāv baktērijās in vivo. Taču neviens nevar liegt pētniekam mākslīgi sintezēt plazmīdu, kurai būs viņam vajadzīgās īpašības, iešūt tajā ieliktņa gēnu un ievadīt to šūnā. Tajā pašā plazmīdā var ievietot dažādus ieliktņus .

Gēnu terapijas metodes

Ir divas galvenās pieejas, kas atšķiras pēc mērķa šūnu rakstura:

1. Auglis, kurā sveša DNS tiek ievadīta zigotā (apaugļotā olšūnā) vai embrijā agrīnā attīstības stadijā; šajā gadījumā ir sagaidāms, ka ievadītais materiāls iekļūs visās saņēmēja šūnās (un pat dzimumšūnās, tādējādi nodrošinot pārnešanu uz nākamo paaudzi). Mūsu valstī tas faktiski ir aizliegts;

2. Somatisks, kurā ģenētiskais materiāls tiek ievadīts jau dzimušo nedzimuma šūnās un tas netiek pārnests uz dzimumšūnām.

Gēnu terapija in vivo ir balstīta uz klonētu (reizinātu) un īpaši iepakotu DNS sekvenču tiešu ievadīšanu noteiktos pacienta audos. Īpaši daudzsološa gēnu slimību ārstēšanā in vivo ir gēnu ieviešana, izmantojot aerosola vai injicējamās vakcīnas. Aerosola gēnu terapija parasti tiek izstrādāta plaušu slimību (cistiskās fibrozes, plaušu vēža) ārstēšanai.

Pirms gēnu terapijas programmas izstrādes notiek daudzi posmi. Tas ietver rūpīgu attiecīgā gēna audu specifiskās ekspresijas analīzi (t.i., dažu proteīnu sintēzi uz gēnu matricas noteiktā audos), primārā bioķīmiskā defekta identificēšanu, kā arī struktūras, funkcijas un tā proteīna produkta intracelulāro izplatību, kā arī bioķīmiskā analīze patoloģisks process. Visi šie dati tiek ņemti vērā, sastādot atbilstošu medicīnisko protokolu.

Ir svarīgi, lai, sastādot shēmas gēnu korekcijai, tiktu ņemta vērā transfekcijas efektivitāte, primārā bioķīmiskā defekta korekcijas pakāpe šūnu kultūras apstākļos ( in vitro,"in vitro") un, pats galvenais, in vivo par dzīvnieku bioloģiskajiem modeļiem. Tikai pēc tam var sākties klīniskās izpētes programma. .

Terapeitisko gēnu tiešā piegāde un šūnu nesēji

Ir daudzas metodes svešas DNS ievadīšanai eikariotu šūnā: dažas paļaujas uz fizisku apstrādi (elektroporāciju, magnetofekciju u.c.), citas uz ķīmisko materiālu vai bioloģisko daļiņu (piemēram, vīrusu) izmantošanu, ko izmanto kā nesējus. Uzreiz ir vērts pieminēt, ka parasti tiek kombinētas ķīmiskās un fizikālās metodes (piemēram, elektroporācija + DNS ietīšana ar liposomām)

Tiešās metodes

1. Uz ķīmiskām vielām balstītu transfekciju var iedalīt vairākos veidos: izmantojot ciklodekstrīna vielu, polimērus, liposomas vai nanodaļiņas (ar vai bez ķīmiskas vai vīrusu funkcionalizācijas, t.i., virsmas modifikācijas).
a) Viena no lētākajām metodēm ir kalcija fosfāta izmantošana. Tas palielina DNS iekļaušanas šūnās efektivitāti 10-100 reizes. DNS veido spēcīgu kompleksu ar kalciju, kas nodrošina tā efektīvu uzsūkšanos. Trūkums ir tāds, ka tikai aptuveni 1-10% DNS sasniedz kodolu. Izmantotā metode in vitro pārnest DNS cilvēka šūnās (3. att.);

3. att

b) Augsti sazarotu organisko molekulu - dendrimēra izmantošana DNS saistīšanai un pārnesei uz šūnu (4. att.);

4. att

c) Ļoti efektīva DNS transfekcijas metode ir tās ievadīšana caur liposomām – maziem, membrānu ieskautiem ķermeņiem, kas var saplūst ar šūnu citoplazmas membrānu (CPM), kas ir dubults lipīdu slānis. Eikariotu šūnām transfekcija ir efektīvāka ar katjonu liposomām, jo ​​šūnas ir jutīgākas pret tām. Procesam ir savs nosaukums – lipofekcija. Šī metode mūsdienās tiek uzskatīta par vienu no drošākajām. Liposomas nav toksiskas un nav imunogēnas. Tomēr gēnu pārneses efektivitāte, izmantojot liposomas, ir ierobežota, jo DNS, ko tās ievada šūnās, parasti nekavējoties uztver lizosomas un iznīcina. DNS ievadīšana cilvēka šūnās ar liposomu palīdzību ir mūsdienu terapijas pamats. in vivo(5. att.);

5. att

d) Vēl viena metode ir katjonu polimēru, piemēram, dietilaminoetildekstrāna vai polietilēnimīna, izmantošana. Negatīvi lādētas DNS molekulas saistās ar pozitīvi lādētiem polikationiem, un pēc tam šis komplekss endocitozes ceļā nonāk šūnā. DEAE-dekstrāns maina plazmas membrānas fizikālās īpašības un stimulē šī kompleksa uzņemšanu šūnā. Galvenais metodes trūkums ir tas, ka DEAE-dekstrāns lielā koncentrācijā ir toksisks. Metode nav saņēmusi izplatību gēnu terapijā;

e) Ar histonu un citu kodolproteīnu palīdzību. Šie proteīni, kas satur daudzas pozitīvi lādētas aminoskābes (Lys, Arg), dabiskos apstākļos palīdz kompakti iesaiņot garu DNS ķēdi salīdzinoši mazā šūnas kodolā.

2. Fiziskās metodes:

a) Elektroporācija ir ļoti populāra metode; Tūlītēja membrānas caurlaidības palielināšanās tiek panākta tāpēc, ka šūnas tiek pakļautas īslaicīgai intensīva elektriskā lauka iedarbībai. Ir pierādīts, ka optimālos apstākļos transformantu skaits var sasniegt 80% izdzīvojušo šūnu. Pašlaik to neizmanto cilvēkiem (6. att.).

6. att

b) "Šūnu saspiešana" - 2013. gadā izgudrota metode, kas ļauj nogādāt šūnās molekulas, "maigi saspiežot" šūnu membrānu. Metode novērš toksicitātes vai nepareizas trāpījuma iespēju uz mērķi, jo tā nav atkarīga no ārējiem materiāliem vai elektriskiem laukiem;

c) Sonoporācija - metode svešas DNS mākslīgai pārnešanai šūnās, pakļaujot tās ultraskaņai, kas izraisa poru atvēršanos šūnas membrānā;
d) Optiskā transfekcija - metode, kurā, izmantojot ļoti fokusētu lāzeru, membrānā tiek izveidots niecīgs caurums (apmēram 1 µm diametrā);
e) Hidrodinamiskā transfekcija - metode ģenētisko konstrukciju, olbaltumvielu utt. piegādei. kontrolēti palielinot spiedienu kapilāros un intersticiālajā šķidrumā, kas izraisa īslaicīgu šūnu membrānu caurlaidības palielināšanos un īslaicīgu poru veidošanos tajās. To veic ar ātru injekciju audos, bet piegāde nav specifiska. Piegādes efektivitāte skeleta muskuļiem - 22 līdz 60% ;

f) DNS mikroinjekcija - ievadīšana dzīvnieku šūnu kodolā, izmantojot plānas stikla mikrotubulas (d=0,1-0,5 µm). Trūkums ir metodes sarežģītība, liela kodola vai DNS iznīcināšanas iespējamība; ierobežotu skaitu šūnu var pārveidot. Nav lietots cilvēkiem.

3. Metodes, kuru pamatā ir daļiņas.

a) Tieša pieeja transfekcijai ir gēnu lielgabals, kurā DNS ir savienota nanodaļiņā ar inertām cietām vielām (parasti zeltu, volframu), kas pēc tam "šauj" uz mērķa šūnu kodoliem. Šī metode tiek piemērota in vitro un in vivo gēnu ievadīšanai, jo īpaši muskuļu audu šūnās, piemēram, tādā slimībā kā Dišēna muskuļu distrofija. Zelta daļiņu izmērs ir 1-3 mikroni (7. att.).

7. att

b) Magnetofekcija – metode, kas izmanto magnētisma spēkus, lai DNS nogādātu mērķa šūnās. Pirmkārt, nukleīnskābes (NA) ir saistītas ar magnētiskajām nanodaļiņām, un pēc tam magnētiskā lauka iedarbībā daļiņas tiek iedzītas šūnā. Efektivitāte ir gandrīz 100%, tiek atzīmēta acīmredzama netoksicitāte. Jau pēc 10-15 minūtēm daļiņas tiek reģistrētas šūnā - tas ir daudz ātrāk nekā citas metodes.
c) Impalefection (impalefection; "impalement", lit. "impaling" + "infection") - piegādes metode, izmantojot nanomateriālus, piemēram, oglekļa nanocaurules un nanošķiedras. Šajā gadījumā šūnas tiek burtiski caurdurtas ar nanofibrilu pārklājumu. Prefiksu "nano" lieto, lai apzīmētu to ļoti mazos izmērus (metra miljarddaļās) (8. att.).

8. att

Atsevišķi ir vērts izcelt tādu metodi kā RNS transfekcija: šūnā tiek piegādāta nevis DNS, bet gan RNS molekulas - to "pēcteči" olbaltumvielu biosintēzes ķēdē; tajā pašā laikā tiek aktivizēti īpaši proteīni, kas sagriež RNS īsos fragmentos - tā sauktajos. maza traucējoša RNS (siRNS). Šie fragmenti saistās ar citiem proteīniem, un galu galā tas noved pie attiecīgo gēnu ekspresijas kavēšanas šūnā. Tādējādi ir iespējams bloķēt to gēnu darbību šūnā, kas šobrīd potenciāli nodara vairāk ļauna nekā laba. RNS transfekcija ir atradusi plašu pielietojumu, jo īpaši onkoloģijā.

Tiek apskatīti gēnu piegādes pamatprincipi, izmantojot plazmīdu vektorus. Tagad mēs varam pāriet pie vīrusu metožu izskatīšanas. Vīrusi ir ne-šūnu dzīvības formas, visbiežāk nukleīnskābes molekula (DNS vai RNS), kas ietīta proteīna apvalkā. Ja no vīrusa ģenētiskā materiāla izgriežam visas tās sekvences, kas izraisa slimību rašanos, tad arī visu vīrusu var veiksmīgi pārvērst par mūsu gēna “nesēju”.

DNS ievadīšanas procesu šūnā sauc par vīrusa starpniecību transdukcija.
Praksē visbiežāk tiek izmantoti retrovīrusi, adenovīrusi un ar adeno saistītie vīrusi (AAV). Sākumā ir vērts izdomāt, kam vajadzētu būt ideālam vīrusa pārnešanas kandidātam. Kritēriji ir tādi, ka tam jābūt:

stabils;
. spēja, tas ir, saturēt pietiekamu daudzumu DNS;
. inerts attiecībā pret šūnas vielmaiņas ceļiem;
. precīzs - ideālā gadījumā tam vajadzētu integrēt savu genomu noteiktā saimnieka kodola genoma lokusā utt.

Reālajā dzīvē ir ļoti grūti apvienot kaut dažus punktus, tāpēc parasti izvēle notiek, izskatot katru atsevišķu gadījumu atsevišķi (9. att.).

9. att

No trim uzskaitītajiem visbiežāk lietotajiem vīrusiem AAV ir visdrošākais un tajā pašā laikā visprecīzākais. Gandrīz vienīgais to trūkums ir salīdzinoši mazā ietilpība (apmēram 4800 bp), kas tomēr izrādās pietiekama daudziem gēniem .

Papildus iepriekš minētajām metodēm gēnu terapiju bieži izmanto kombinācijā ar šūnu terapiju: vispirms uzturvielu barotnē tiek stādīta noteiktu cilvēka šūnu kultūra, pēc tam šūnās tādā vai citādā veidā tiek ievadīti nepieciešamie gēni, kultivēti. kādu laiku un atkal pārstādīts saimniekorganismā. Tā rezultātā šūnas var atgriezties pie to parastajām īpašībām. Tā, piemēram, cilvēka leikocīti (leikocīti) tika modificēti leikēmijas gadījumā (10. att.).

10. att

Gēna liktenis pēc tā iekļūšanas šūnā

Tā kā ar vīrusu vektoriem viss ir vairāk vai mazāk skaidrs, pateicoties to spējai efektīvāk nogādāt gēnus gala mērķim – kodolam, tad pakavēsimies pie plazmīda vektora likteņa.

Šajā posmā esam panākuši, ka DNS ir šķērsojusi pirmo lielo barjeru – šūnas citoplazmas membrānu.

Turklāt kombinācijā ar citām vielām, ar vai bez čaumalas, tai ir jāsasniedz šūnas kodols, lai īpašs enzīms - RNS polimerāze - uz DNS veidnes sintezētu RNS (mRNS) molekulu (šo procesu sauc transkripcija). Tikai pēc tam mRNS iekļūs citoplazmā, veidos kompleksu ar ribosomām, un saskaņā ar ģenētisko kodu tiek sintezēts polipeptīds - piemēram, asinsvadu augšanas faktors (VEGF), kas sāks veikt noteiktu terapeitisko funkciju ( šajā gadījumā tas sāks asinsvadu atzarojuma veidošanās procesu audos, kas pakļauti išēmijai).

Kas attiecas uz ievadīto gēnu ekspresiju vēlamajā šūnu tipā, šī problēma tiek atrisināta ar transkripcijas regulējošo elementu palīdzību. Audus, kuros notiek ekspresija, bieži nosaka audiem specifiska pastiprinātāja (“uzlabošanas” secības) kombinācija ar noteiktu promotoru (nukleotīdu secība, no kuras RNS polimerāze sāk sintēzi), kas var būt inducējama. . Ir zināms, ka gēnu aktivitāti var modulēt in vivoārējiem signāliem, un tā kā pastiprinātāji var darboties ar jebkuru gēnu, izolatorus var ievadīt arī vektoros, kas palīdz pastiprinātājam darboties neatkarīgi no tā atrašanās vietas un var darboties kā funkcionālas barjeras starp gēniem. Katrs pastiprinātājs satur saistīšanās vietu kopumu proteīna faktoru aktivizēšanai vai nomākšanai. Promotori var arī regulēt gēnu ekspresijas līmeni. Piemēram, ir metalotioneīns vai temperatūras jutīgie promotori; hormonu vadīti veicinātāji.

Gēna ekspresija ir atkarīga no tā atrašanās vietas genomā. Vairumā gadījumu esošās vīrusu metodes noved tikai pie gēna nejaušas ievietošanas genomā. Lai novērstu šādu atkarību, konstruējot vektorus, gēns tiek nodrošināts ar zināmām nukleotīdu sekvencēm, kas ļauj gēnu ekspresēt neatkarīgi no tā ievietošanas vietas genomā.

Vienkāršākais veids, kā regulēt transgēna ekspresiju, ir nodrošināt to ar indikatora promotoru, kas ir jutīgs pret fizioloģisku signālu, piemēram, glikozes izdalīšanos vai hipoksiju. Šādas "endogēnas" kontroles sistēmas var būt noderīgas dažās situācijās, piemēram, no glikozes atkarīga insulīna ražošanas kontrole. Drošākas un daudzpusīgākas ir "eksogēnas" kontroles sistēmas, kad gēnu ekspresiju kontrolē farmakoloģiski, ieviešot nelielu zāļu molekulu. Šobrīd ir zināmas 4 galvenās kontroles sistēmas – regulē tetraciklīns (Tet), insektu steroīds, ekdizons vai tā analogi, antiprogestīna medikaments maifpristons (RU486) un ķīmiskie dimerizatori, piemēram, rapamicīns un tā analogi. Visi no tiem ietver no narkotikām atkarīgu transkripcijas aktivācijas domēna piesaisti galvenajam promotoram, kas vada vēlamo gēnu, taču atšķiras ar šīs vervēšanas mehānismiem. .

Secinājums

Pārskatot datus, var secināt, ka, neskatoties uz daudzu pasaules laboratoriju pūlēm, visas jau zināmās un pārbaudītās in vivo un in vitro vektoru sistēmas ir tālu no perfektas . Ja svešas DNS piegādes problēma in vitro praktiski atrisināta, un tā piegāde dažādu audu mērķa šūnām in vivo sekmīgi atrisināta (galvenokārt veidojot konstrukcijas, kas pārnēsā receptoru proteīnus, tai skaitā noteiktiem audiem raksturīgus antigēnus), tad vēl nopietni jāuzlabo citi esošo vektoru sistēmu raksturlielumi - integrācijas stabilitāte, regulēta ekspresija, drošība.

Pirmkārt, tas attiecas uz integrācijas stabilitāti. Līdz šim integrācija genomā ir panākta tikai, izmantojot retrovīrusu vai ar adeno saistītus vektorus. Stabilas integrācijas efektivitāti var palielināt, uzlabojot gēnu konstrukcijas, piemēram, receptoru mediētas sistēmas vai izveidojot pietiekami stabilus epizomālos vektorus (tas ir, DNS struktūras, kas spēj ilgstoši uzturēties kodolos). Pēdējā laikā īpaša uzmanība tiek pievērsta vektoru radīšanai, kuru pamatā ir zīdītāju mākslīgās hromosomas. Pateicoties parasto hromosomu strukturālo pamatelementu klātbūtnei, šādas minihromosomas ilgstoši saglabājas šūnās un spēj pārnēsāt pilna izmēra (genomiskos) gēnus un to dabiskos regulējošos elementus, kas nepieciešami pareizai darbībai. pareizajos audos un īstajā laikā.

Gēnu un šūnu terapija paver spožas perspektīvas zaudēto šūnu un audu atjaunošanai un orgānu gēnu inženierijas projektēšanai, kas neapšaubāmi būtiski paplašinās biomedicīnas pētījumu metožu arsenālu un radīs jaunas iespējas cilvēka mūža saglabāšanai un pagarināšanai.