Len o komplexe: ako funguje génová terapia a čo lieči. Genetické choroby – liečba v Nemecku Génom sprostredkovaná enzymatická proliečivá terapia

Počas svojej relatívne krátkej histórie prešla génová terapia „vzostupmi a pádmi“: niekedy ju vedci a praktici považovali takmer za všeliek a potom prišlo obdobie sklamania a skepticizmu…
Myšlienky o možnosti zavedenia génov do tela na terapeutické účely boli vyjadrené začiatkom 60. rokov minulého storočia, ale skutočné kroky boli podniknuté až koncom 80. rokov a úzko súviseli s medzinárodným projektom dešifrovania ľudského genómu.

V roku 1990 sa uskutočnil pokus o génovú terapiu ťažkého, so životom často nezlučiteľného, ​​dedičného imunodeficitu spôsobeného defektom génu kódujúceho syntézu enzýmu adenozíndeamináza. Autori štúdie uviedli jasný terapeutický účinok. A hoci sa časom objavilo množstvo pochybností o pretrvávaní dosiahnutého účinku a jeho špecifických mechanizmoch, práve táto práca poslúžila ako silný impulz pre rozvoj génovej terapie a prilákala mnohomiliardové investície.

Génová terapia je medicínsky prístup založený na zavádzaní génových konštruktov do buniek na liečbu rôzne choroby. Požadovaný efekt sa dosiahne buď ako výsledok expresie zavedeného génu, alebo potlačením funkcie defektného génu. Treba zdôrazniť, že cieľom génovej terapie nie je „liečba“ génov ako takých, ale liečba rôznych chorôb s ich pomocou.

Ako "liek" sa spravidla používa fragment DNA obsahujúci požadovaný gén. Môže to byť jednoducho „nahá DNA“, zvyčajne v kombinácii s lipidmi, proteínmi atď. Ale oveľa častejšie sa DNA zavádza ako súčasť špeciálnych genetických konštruktov (vektorov) vytvorených na báze rôznych ľudských a zvieracích vírusov pomocou množstva genetické manipulácie. Z vírusu sú napríklad odstránené gény potrebné na jeho reprodukciu. To na jednej strane robí vírusové častice prakticky bezpečnými, na druhej strane „uvoľňuje miesto“ pre gény určené na zavedenie do tela.

Základným bodom génovej terapie je prienik génového konštruktu do bunky (transfekcia), vo veľkej väčšine prípadov do jej jadra. Zároveň je dôležité, aby sa génový konštrukt dostal presne k tým bunkám, ktoré treba „ošetriť“. Preto úspešnosť génovej terapie do značnej miery závisí od výberu optimálneho alebo aspoň uspokojivého spôsobu zavádzania génových konštruktov do organizmu.

S vírusovými vektormi je situácia viac-menej predvídateľná: šíria sa po celom tele a prenikajú do buniek ako ich rodičovské vírusy, čím poskytujú pomerne vysokú úroveň orgánovej a tkanivovej špecifickosti. Takéto konštrukty sa zvyčajne podávajú intravenózne, intraperitoneálne, subkutánne alebo intramuskulárne.

Na "cielené dodávanie" nevírusových vektorov bolo vyvinutých množstvo špeciálnych metód. Najjednoduchším spôsobom dodania požadovaného génu do buniek in vivo je priama injekcia genetického materiálu do tkaniva. Použitie tejto metódy je obmedzené: injekcie sa môžu podávať iba do kože, týmusu, priečne pruhovaných svalov, niektorých solídnych nádorov.

Ďalším spôsobom prenosu transgénu je balistická transfekcia. Je založená na „obalení“ orgánov a tkanív mikročasticami ťažkých kovov (zlato, volfrám), pokrytých fragmentmi DNA. Na „lúskanie“ používajú špeciálnu „génovú pištoľ“.

Pri liečbe pľúcnych ochorení je možné zaviesť genetický materiál do dýchacích ciest vo forme aerosólu.

Transfekcia buniek sa môže uskutočniť aj ex vivo: bunky sa izolujú z tela, geneticky sa s nimi upravia a potom sa vstreknú späť do tela pacienta.

Liečime: dedičné...

Na počiatočná fáza vývoj génovej terapie, za jej hlavné predmety boli považované dedičné choroby spôsobené absenciou alebo nedostatočnou funkciou jedného génu, teda monogénne. Predpokladalo sa, že zavedenie normálne fungujúceho génu pacientovi povedie k vyliečeniu choroby. Opakovane sa pokúšali liečiť „kráľovskú chorobu“ – hemofíliu, Duchennovú myodystrofiu, cystickú fibrózu.

Dnes sa vyvíjajú a testujú metódy génovej terapie pre takmer 30 monogénnych ľudských chorôb. Medzitým existuje viac otázok ako odpovedí a skutočný terapeutický účinok sa vo väčšine prípadov nedosiahol. Dôvodom je predovšetkým imunitná odpoveď organizmu, postupné „vyblednutie“ funkcií zavedeného génu, ako aj neschopnosť dosiahnuť „cielenú“ integráciu preneseného génu do chromozomálnej DNA.

Menej ako 10 % štúdií génovej terapie sa venuje monogénnym ochoreniam, zatiaľ čo zvyšok sa týka nededičných patológií.

...a získané

Získané choroby nie sú spojené s vrodenou chybou v štruktúre a funkcii génov. Ich génová terapia je založená na predpoklade, že zavedením „terapeutického génu“ do tela by malo dôjsť k syntéze proteínu, ktorý bude mať buď terapeutický účinok, alebo zvýši individuálnu citlivosť na pôsobenie. lieky.

Génová terapia môže byť použitá na prevenciu trombózy, obnovu cievneho systému srdcového svalu po infarkte myokardu, prevenciu a liečbu aterosklerózy, ako aj v boji proti infekcii HIV a onkologické ochorenia. Napríklad taký spôsob génovej terapie nádorov, ako je zvyšovanie citlivosti nádorových buniek na chemoterapeutické liečivá, sa intenzívne vyvíja, prebiehajú klinické štúdie s účasťou pacientov s mezoteliómom pleury, rakovinou vaječníkov a glioblastómom. V roku 1999 bol schválený protokol na liečbu rakoviny prostaty, vybrané bezpečné dávky chemoterapeutických liekov a preukázané pozitívne výsledky. liečivý účinok.

Bezpečnosť a etika

Vykonávanie genetických manipulácií s ľudským telom kladie osobitné bezpečnostné požiadavky: koniec koncov, každé zavedenie cudzieho genetického materiálu do buniek môže mať negatívne dôsledky. Nekontrolované vkladanie „nových“ génov do určitých častí pacientovho genómu môže viesť k narušeniu funkcie „vlastných“ génov, čo následne môže spôsobiť nežiaduce zmeny v organizme, najmä tvorbu rakovinových nádorov.

Okrem toho môže dôjsť k negatívnym genetickým zmenám v somatických a zárodočných bunkách. V prvom prípade hovoríme o osude jedného človeka, kde je riziko spojené s genetickou korekciou neporovnateľne menšie ako riziko úmrtia na existujúce ochorenie. Keď sa génové konštrukty zavedú do zárodočných buniek, nežiaduce zmeny v genóme sa môžu preniesť na budúce generácie. Preto sa zdá celkom prirodzené snažiť sa zakázať experimenty s genetickou modifikáciou zárodočných buniek nielen z medicínskych, ale aj z etických dôvodov.

S vývojom prístupov ku génovej intervencii do buniek vyvíjajúceho sa ľudského embrya, teda s vnútromaternicovou génovou terapiou (in utero terapia), sa spája množstvo morálnych a etických problémov. V Spojených štátoch sa použitie génovej terapie in utero zvažuje len pri dvoch najzávažnejších genetických ochoreniach: závažná kombinovaná imunodeficiencia spôsobená defektom v géne pre enzým adenozíndeaminázu a homozygotná beta-talasémia, závažné dedičné ochorenie. spojené s absenciou všetkých štyroch globínových génov alebo mutácií v nich. Už bolo vyvinutých a na predbežné testovanie pripravených množstvo génových konštruktov, ktorých dodanie do tela by malo viesť ku kompenzácii genetických defektov a odstráneniu symptómov týchto chorôb. Riziko negatívnych genetických dôsledkov takýchto manipulácií je však dosť vysoké. Preto aj etika vnútromaternicovej génovej terapie zostáva kontroverzná.

V januári tohto roku boli v USA opäť dočasne zakázané experimenty s génovou terapiou. Dôvodom bolo nebezpečné komplikácie ktorý vznikol u dvoch detí po génovej terapii dedičnej imunodeficiencie. Pred niekoľkými mesiacmi vo Francúzsku zistili, že jedno z detí, o ktorých sa predpokladalo, že sa vyliečilo génovou terapiou, má syndróm podobný leukémii. Odborníci nevylučujú, že práve používanie vektorov na báze retrovírusov počas terapie môže byť príčinou rozvoja komplikácií u detí. Teraz zástupcovia Úradu pre kontrolu potravín a lieky(FDA) zváži pokračovanie experimentov s génovou terapiou od prípadu k prípadu a iba vtedy, ak neexistujú žiadne iné spôsoby liečby choroby.

Nie všeliek, ale perspektíva

Nemožno poprieť, že skutočný úspech génovej terapie v liečbe konkrétnych pacientov je skôr skromný a samotný prístup je zatiaľ v štádiu hromadenia dát a vývoja technológií. Génová terapia sa nestala a samozrejme ani nikdy nebude všeliekom. Regulačné systémy tela sú také zložité a tak málo prebádané, že jednoduché zavedenie génu vo väčšine prípadov nespôsobí požadovaný terapeutický účinok.

Pri tomto všetkom však možno len ťažko preceňovať vyhliadky génovej terapie. Je dôvod dúfať, že pokrok v oblasti molekulárnej genetiky a technológií genetického inžinierstva povedie k nepochybným úspechom v liečbe ľudských chorôb pomocou génov. A nakoniec, génová terapia právom zaujme svoje miesto v praktickej medicíne.

Zdá sa, že génová terapia môže mať nejaké neočakávané aplikácie. Podľa vedcov sa v roku 2012 budú konať olympijské hry, kde sa predstavia transgénni superšportovci. "DNA-doping" prinesie nesporné výhody
v rozvoji sily, vytrvalosti a rýchlosti. Niet pochýb o tom, že v silnej konkurencii sa nájdu športovci, ktorí sú pripravení na genetickú modifikáciu, a to aj vzhľadom na možné riziká spojené s používaním novej technológie.

Poznámka!

Táto práca bola prihlásená do súťaže populárno-vedeckých článkov v nominácii „Najlepší recenzia“.

Smrteľné pazúry

Ľudstvo čelilo tejto záhadnej chorobe ešte pred naším letopočtom. Vedci sa ju snažili pochopiť a liečiť v rôznych častiach sveta: v starovekom Egypte - Ebers, v Indii - Sushruta, Grécko - Hippokrates. Všetci a mnohí ďalší lekári bojovali proti nebezpečnému a vážnemu protivníkovi – rakovine. A hoci tento boj trvá dodnes, je ťažké určiť, či existuje šanca na úplné a konečné víťazstvo. Koniec koncov, čím viac študujeme túto chorobu, tým častejšie vznikajú otázky - je možné úplne vyliečiť rakovinu? Ako sa vyhnúť chorobe? Je možné, aby bola liečba rýchla, dostupná a lacná?

Vďaka Hippokratovi a jeho pozorovaniu (bol to on, kto videl podobnosť nádoru a chápadiel rakoviny) sa tento termín objavil v starovekých lekárskych pojednaniach karcinóm(grécky carcinos) príp rakovina(lat. rakovina). V lekárskej praxi sa zhubné novotvary klasifikujú odlišne: karcinómy (z epitelových tkanív), sarkómy (z spojivového, svalového tkaniva), leukémia (v krvi a kostnej dreni), lymfómy (v lymfatický systém) a iné (vyvíjajú sa v iných typoch buniek, napr. glióm – rakovina mozgu). Ale v každodennom živote je výraz "rakovina" viac populárny, čo znamená akýkoľvek malígny nádor.

Mutácie: zahynúť alebo žiť navždy?

Početné genetické štúdie ukázali, že výskyt rakovinových buniek je výsledkom genetických zmien. Chyby v replikácii DNA (kopírovanie) a oprave (oprava chýb) vedú k zmenám v génoch, vrátane tých, ktoré riadia delenie buniek. Hlavné faktory, ktoré prispievajú k poškodeniu genómu a následne k získaniu mutácií, sú endogénne (útok voľné radikály vznikajúce pri metabolizme, chemická nestabilita niektorých báz DNA) a exogénne (ionizujúce a UV žiarenie, chemické karcinogény). Keď sú mutácie fixované v genóme, prispievajú k transformácii normálnych buniek na rakovinové bunky. Takéto mutácie sa vyskytujú hlavne v protoonkogénoch, ktoré normálne stimulujú delenie buniek. Výsledkom je, že sa dá získať trvalo „on“ gén a mitóza (delenie) sa nezastaví, čo v skutočnosti znamená malígnu degeneráciu. Ak dôjde k inaktivačným mutáciám v génoch, ktoré normálne inhibujú proliferáciu (nádorové supresorové gény), kontrola nad delením sa stratí a bunka sa stane „nesmrteľnou“ (obr. 1).

Obrázok 1. Genetický model rakoviny: rakovina hrubého čreva. Prvým krokom je strata alebo inaktivácia dvoch alel génu APS na piatom chromozóme. V prípade familiárnej rakoviny (familiárna adenomatózna polypóza, FAP) sa zdedí jedna mutácia APC génu. Strata oboch alel vedie k vzniku benígnych adenómov. Následné génové mutácie na chromozómoch 12, 17, 18 benígneho adenómu môžu viesť k transformácii na malígny nádor. Zdroj: .

Je zrejmé, že vývoj určitých typov rakoviny zahŕňa zmenu väčšiny alebo dokonca všetkých týchto génov a môže sa vyskytnúť rôznymi spôsobmi. Z toho vyplýva, že každý nádor treba považovať za biologicky jedinečný objekt. K dnešnému dňu existujú špeciálne databázy genetických informácií o rakovine, ktoré obsahujú údaje o 1,2 miliónoch mutácií z 8207 vzoriek tkaniva patriacich k 20 typom nádorov: Cancer Genome Atlas a Katalóg somatických mutácií pri rakovine pri rakovine (COSMIC) .

Výsledkom zlyhania génu je nekontrolované delenie buniek a v nasledujúcich štádiách metastázy do rôznych orgánov a častí tela cez krvné a lymfatické cievy. Ide o pomerne zložitý a aktívny proces, ktorý pozostáva z niekoľkých etáp. Jednotlivé rakovinové bunky sú oddelené od primárneho ohniska a prenášané krvou po celom tele. Potom sa pomocou špeciálnych receptorov naviažu na endotelové bunky a exprimujú proteinázy, ktoré štiepia matricové proteíny a vytvárajú póry v bazálnej membráne. Zničením extracelulárnej matrice rakovinové bunky migrujú hlboko do zdravého tkaniva. V dôsledku autokrinnej stimulácie sa delia a vytvárajú uzol (priemer 1-2 mm). Pri nedostatku výživy niektoré bunky v uzle odumierajú a takéto „spiace“ mikrometastázy môžu zostať latentne v tkanivách orgánu pomerne dlho. Za priaznivých podmienok uzol rastie, v bunkách sa aktivujú gény vaskulárneho endotelového rastového faktora (VEGF) a fibroblastového rastového faktora (FGFb) a iniciuje sa angiogenéza (tvorba krvných ciev) (obr. 2).

Bunky sú však vyzbrojené špeciálnymi mechanizmami, ktoré chránia pred vznikom nádorov:

Tradičné metódy a ich nevýhody

Ak obranné systémy tela zlyhali a nádor sa napriek tomu začal rozvíjať, môže zachrániť iba lekársky zásah. Po dlhú dobu lekári používali tri hlavné "klasické" terapie:

• chirurgické (úplné odstránenie nádoru). Používa sa, keď je nádor malý a dobre lokalizovaný. Odstráňte aj časť tkanív, ktoré sú v kontakte s malígnym novotvarom. Metóda sa neuplatňuje v prítomnosti metastáz;
• žiarenie - ožarovanie nádoru rádioaktívnymi časticami na zastavenie a zabránenie delenia rakovinových buniek. Zdravé bunky sú tiež citlivé na toto žiarenie a často zomierajú;
• chemoterapia - používajú sa lieky, ktoré inhibujú rast rýchlo sa deliacich buniek. Lieky majú negatívny vplyv na normálne bunky.

Vyššie uvedené prístupy nemôžu vždy zachrániť pacienta pred rakovinou. Počas chirurgickej liečby často zostávajú jednotlivé rakovinové bunky a nádor môže recidivovať a počas chemoterapie a rádioterapie sa vyskytujú vedľajšie účinky(znížená imunita, anémia, vypadávanie vlasov a pod.), ktoré vedú k vážnym následkom, často až k smrti pacienta. S každým ďalším rokom sa však tradičné spôsoby liečby zlepšujú a objavujú sa nové spôsoby liečby, ktoré dokážu rakovinu poraziť, ako je biologická liečba, hormonálna liečba, používanie kmeňových buniek, transplantácia kostnej drene, ale aj rôzne podporné terapie. Génová terapia sa považuje za najsľubnejšiu, keďže je zameraná na základnú príčinu rakoviny – kompenzáciu nesprávneho fungovania niektorých génov.

Génová terapia ako perspektíva

Podľa PubMed záujem o génovú terapiu (HT) pre rakovinu rýchlo rastie a dnes HT kombinuje množstvo techník, ktoré pôsobia na rakovinové bunky a v tele ( in vivo) a mimo neho ( ex vivo) (obr. 3).

Obrázok 3. Dve hlavné stratégie génovej terapie. Ex vivo- genetický materiál sa prenesie pomocou vektorov do buniek pestovaných v kultúre (transdukcia) a potom sa transgénne bunky vnesú do príjemcu; in vivo- zavedenie vektora s požadovaným génom do špecifického tkaniva alebo orgánu. Obrázok z .

Génová terapia in vivo zahŕňa prenos génov - zavedenie genetických konštruktov do rakovinových buniek alebo do tkanív, ktoré obklopujú nádor. Génová terapia ex vivo spočíva v izolácii rakovinových buniek od pacienta, vložení terapeutického "zdravého" génu do rakovinového genómu a zavedení transdukovaných buniek späť do tela pacienta. Na takéto účely sa používajú špeciálne vektory vytvorené genetickým inžinierstvom. Spravidla ide o vírusy, ktoré detegujú a ničia rakovinové bunky, pričom zostávajú neškodné pre zdravé telesné tkanivá, alebo nevírusové vektory.

Vírusové vektory

Ako vírusové vektory sa používajú retrovírusy, adenovírusy, adeno-asociované vírusy, lentivírusy, herpes vírusy a iné. Tieto vírusy sa líšia účinnosťou transdukcie, interakciou s bunkami (rozpoznanie a infekcia) a DNA. Hlavným kritériom je bezpečnosť a absencia rizika nekontrolovaného šírenia vírusovej DNA: ak sú gény vložené na nesprávne miesto v ľudskom genóme, môžu vytvárať škodlivé mutácie a iniciovať vývoj nádoru. Je tiež dôležité vziať do úvahy úroveň expresie prenesených génov, aby sa zabránilo zápalovým alebo imunitným reakciám tela počas hypersyntézy cieľových proteínov (tabuľka 1).

Nevírusové vektory

Nevírusové vektory sa tiež používajú na prenos transgénnej DNA. Polymérne nosiče liečiv - nanočasticové konštrukty - sa používajú na dodávanie liečiv s nízkou molekulovou hmotnosťou, ako sú oligonukleotidy, peptidy, miRNA. Vďaka malá veľkosť, sú nanočastice absorbované bunkami a môžu prenikať do kapilár, čo je veľmi výhodné na dodávanie „liečivých“ molekúl do najneprístupnejších miest v tele. Táto technika sa často používa na inhibíciu nádorovej angiogenézy. Existuje však riziko hromadenia častíc v iných orgánoch, ako je kostná dreň, čo môže viesť k nepredvídateľným následkom. Najpopulárnejšími metódami dodávania nevírusovej DNA sú lipozómy a elektroporácia.

Syntetický katiónové lipozómy sú teraz uznávané ako sľubný spôsob dodania funkčných génov. Kladný náboj na povrchu častíc zaisťuje fúziu so záporne nabitými bunkovými membránami. Katiónové lipozómy neutralizujú negatívny náboj reťazca DNA, robia jeho priestorovú štruktúru kompaktnejšou a podporujú účinnú kondenzáciu. Plazmid-lipozómový komplex má množstvo dôležitých výhod: môžu pojať genetické konštrukty prakticky neobmedzenej veľkosti, neexistuje riziko replikácie alebo rekombinácie a prakticky nespôsobuje imunitnú odpoveď v hostiteľskom organizme. Nevýhodou tohto systému je krátke trvanie terapeutického účinku a pri opakovanom podávaní sa môžu vyskytnúť nežiaduce účinky.

elektroporácia je populárny nevírusový spôsob dodávania DNA, ktorý je pomerne jednoduchý a nevyvoláva imunitnú odpoveď. S pomocou vyvolaného elektrické impulzy na povrchu buniek sa tvoria póry a plazmidová DNA ľahko preniká do vnútrobunkového priestoru. Génová terapia in vivo použitie elektroporácie preukázalo svoju účinnosť v mnohých experimentoch na myších nádoroch. Môžu sa prenášať akékoľvek gény, napríklad cytokínové (IL-12) a cytotoxické gény (TRAIL), čo prispieva k rozvoju širokého spektra terapeutických stratégií. Okrem toho môže byť tento prístup účinný pri liečbe metastatických aj primárnych nádorov.

Výber techniky

V závislosti od typu nádoru a jeho progresie sa pre pacienta vyberie najúčinnejšia liečebná metóda. K dnešnému dňu boli vyvinuté nové sľubné techniky génovej terapie proti rakovine, vrátane onkolytického vírusového HT, proliečivového HT (prekurzorová terapia), imunoterapie, HT s použitím kmeňových buniek.

Onkolytická vírusová génová terapia

Na túto techniku ​​sa využívajú vírusy, ktoré sa pomocou špeciálnych genetických manipulácií stávajú onkolytické – prestávajú sa množiť v zdravých bunkách a ovplyvňujú len nádorové bunky. Dobrým príkladom takejto terapie je ONYX-015, modifikovaný adenovírus, ktorý neexprimuje E1B proteín. V neprítomnosti tohto proteínu sa vírus nemôže replikovať v bunkách s normálnym génom p53. Dva vektory založené na víruse herpes simplex (HSV-1) - G207 a NV1020 - tiež nesú niekoľko génových mutácií, ktoré sa môžu replikovať iba v rakovinových bunkách. Veľkou výhodou tejto techniky je, že keď sa aplikujú intravenózne injekcie, onkolytické vírusy sa prenášajú krvou do celého tela a môžu bojovať proti metastázam. Hlavnými problémami, ktoré vznikajú pri práci s vírusmi, je možné riziko imunitnej odpovede v tele príjemcu, ako aj nekontrolovaná integrácia genetických konštruktov do genómu zdravých buniek a v dôsledku toho vznik rakovinového nádoru. .

Génom sprostredkovaná enzymatická proliečivá terapia

Je založená na zavedení „samovražedných“ génov do nádorového tkaniva, v dôsledku čoho rakovinové bunky odumierajú. Tieto transgény kódujú enzýmy, ktoré aktivujú intracelulárne cytostatiká, TNF receptory a ďalšie dôležité zložky pre aktiváciu apoptózy. Samovražedná kombinácia proliečivových génov by mala ideálne spĺňať nasledujúce požiadavky: riadená génová expresia; správna konverzia vybraného proliečiva na aktívne protirakovinové činidlo; úplná aktivácia proliečiva bez ďalších endogénnych enzýmov.

Nevýhodou terapie je, že nádory obsahujú všetky ochranné mechanizmy vlastné zdravým bunkám a tie sa postupne adaptujú na škodlivé faktory a proliečivo. Proces adaptácie je uľahčený expresiou cytokínov (autokrinná regulácia), regulačných faktorov bunkový cyklus(výber najodolnejších rakovinových klonov), MDR gén (zodpovedný za náchylnosť na niektoré lieky).

Imunoterapia

Vďaka génovej terapii sa v poslednom čase začala aktívne rozvíjať imunoterapia - nový prístup na liečbu rakoviny protinádorovými vakcínami. Hlavnou stratégiou metódy je aktívna imunizácia organizmu proti rakovinové antigény(TAA) pomocou technológie prenosu génov [?18].

Hlavný rozdiel medzi rekombinantnými vakcínami a inými liekmi je v tom, že pomáhajú imunitnému systému pacienta rozpoznať rakovinové bunky a zničiť ich. V prvej fáze sa rakovinové bunky získajú z tela príjemcu (autológne bunky) alebo zo špeciálnych bunkových línií (alogénne bunky) a potom sa pestujú in vitro. Aby boli tieto bunky rozpoznané imunitným systémom, zavedie sa jeden alebo viacero génov, ktoré produkujú imunostimulačné molekuly (cytokíny) alebo proteíny s zvýšené množstvo antigény. Po týchto modifikáciách bunky pokračujú v kultivácii, potom sa uskutoční lýza a získa sa hotová vakcína.

Široká škála vírusových a nevírusových transgénových vektorov umožňuje experimentovanie na rôznych typoch imunitných buniek (napr. cytotoxické T bunky a dendritické bunky) na inhibíciu imunitnej odpovede a regresiu rakovinových buniek. V 90. rokoch minulého storočia sa predpokladalo, že lymfocyty infiltrujúce nádor (TIL) sú zdrojom cytotoxických T lymfocytov (CTL) a prirodzených zabíjačských (NK) buniek pre rakovinové bunky. Keďže TIL sa dá ľahko manipulovať ex vivo, sa stali prvými geneticky modifikovanými imunitných buniek, ktoré sa aplikovali na imunoterapiu rakoviny. V T-bunkách odobratých z krvi pacienta s rakovinou sa menia gény, ktoré sú zodpovedné za expresiu receptorov pre rakovinové antigény. Je tiež možné pridať gény pre väčšie prežitie a účinný vstup modifikovaných T buniek do nádoru. Pomocou takýchto manipulácií sa vytvárajú vysoko aktívni "zabijaci" rakovinových buniek.

Keď sa ukázalo, že väčšina druhov rakoviny má špecifické antigény a je schopná indukovať svoje vlastné obranné mechanizmy, vznikla hypotéza, že blokovanie imunitného systému rakovinových buniek uľahčí odmietnutie nádoru. Na výrobu väčšiny protinádorových vakcín sa preto ako zdroj antigénov používajú nádorové bunky pacienta alebo špeciálne alogénne bunky. Hlavnými problémami nádorovej imunoterapie sú pravdepodobnosť autoimunitných reakcií v tele pacienta, absencia protinádorovej odpovede, imunostimulácia rastu nádoru a iné.

kmeňových buniek

Silným nástrojom génovej terapie je použitie kmeňových buniek ako vektorov na prenos terapeutických činidiel – imunostimulačných cytokínov, „samovražedných“ génov, nanočastíc a antiangiogénnych proteínov. Kmeňové bunky (SC), okrem schopnosti samoobnovy a diferenciácie, majú oproti iným transportným systémom (nanopolyméry, vírusy) obrovskú výhodu: aktivácia proliečiv prebieha priamo v nádorových tkanivách, čím sa predchádza systémovej toxicite (expresia transgénu prispieva k tzv. ničenie iba rakovinových buniek). Ďalšou pozitívnou kvalitou je "privilegovaný" stav autológnych SC - použité vlastné bunky zaručujú 100% kompatibilitu a zvyšujú úroveň bezpečnosti zákroku. Účinnosť terapie však závisí od správneho ex vivo prenos modifikovaného génu do SC a následný prenos transdukovaných buniek do tela pacienta. Okrem toho je pred aplikáciou terapie vo veľkom meradle potrebné podrobne preštudovať všetky možné spôsoby transformácie SC na rakovinové bunky a vyvinúť bezpečnostné opatrenia na zabránenie karcinogénnej transformácie SC.

Záver

Ak to zhrnieme, môžeme s istotou povedať, že prichádza éra personalizovanej medicíny, kedy je isté účinná terapia. Už sa vyvíjajú individuálne liečebné programy, ktoré poskytujú včasnú a správnu starostlivosť a vedú k výraznému zlepšeniu stavu pacientov. Evolučné prístupy k personalizovanej onkológii, ako je genomická analýza, cielená výroba liekov, génová terapia rakoviny a molekulárna diagnostika založená na biomarkeroch, už prinášajú svoje ovocie.

Génová terapia je obzvlášť sľubnou metódou liečby rakoviny. V súčasnosti prebiehajú klinické štúdie, ktoré často potvrdzujú účinnosť HT v prípadoch, keď štandardná protinádorová liečba – operácia, rádioterapia a chemoterapia – nepomáha. Rozvoj inovatívnych metód HT (imunoterapia, onkolytická viroterapia, „samovražedná“ terapia atď.) dokáže vyriešiť problém vysokej úmrtnosti na rakovinu a možno v budúcnosti nebude diagnostika „rakoviny“ znieť ako veta.

Rakovina: rozpoznať, predchádzať a odstrániť chorobu.

Literatúra

1. Williams S. Klug, Michael R. Cummingm. Svet biológie a medicíny. Základy genetiky. Moskva: Technosfera, 2007. - 726 s.;
2. Bioinformatika: Veľké databázy vs Big Ps;
3. Cui H., Cruz-Correa M. a kol. (2003).

Viete, že u nás existuje liek na génovú terapiu? Tento liek úspešne lieči bežné ochorenie súvisiace s vekom, prešiel klinickými skúškami a v Rusku sa predáva od roku 2012. A samotná droga je domáca a jediná svojho druhu, na svete neexistujú žiadne analógy. Typická reakcia človeka, ktorý o tom počuje prvýkrát: "No tak, to nie je možné." Nedá sa, ale stáva sa. Aby sme čitateľom povedali o lieku s názvom „Neovasculgen“, spýtali sme sa kandidáta lekárskych vied Roman Vadimovič Deev, vedecký riaditeľ.

Nápad a realizácia

Myšlienka použitia plazmidových génových konštruktov na vyvolanie vaskulárneho rastu na terapeutické účely rozhodne nepatrí Inštitútu ľudských kmeňových buniek. História problému siaha najmenej dve desaťročia dozadu - priekopníkmi tu boli Dr. Jeffrey Isner a spoluautori (USA), ktorí vykonali pilotnú štúdiu najprv na jednom pacientovi, potom na troch a výsledky zverejnili v polovici -90-te roky. V tomto ohľade sme išli v ich stopách, ale špecifický vývoj, ktorý je základom tejto drogy, je ruský. Plazmidový konštrukt obsahujúci gén vaskulárneho rastového faktora bol vytvorený a patentovaný v roku 2007 dvoma odborníkmi: doktorkou biologických vied, profesorkou S.L. Vavilovou) a doktorom biologických vied profesorom A. V. Itkesom (Univerzita priateľstva ľudí v Rusku).

Nie každá myšlienka, akokoľvek krásna a teoreticky správna, sa však prevedie do praxe. V prvom rade ide o medicínu, odvetvie, ktoré je nevyhnutne konzervatívne, kde je vždy relevantné tvrdenie „najlepší je nepriateľ dobra“. Prvá otázka, ktorú sme si pred začatím práce položili, bola: Existuje nejaký nevyriešený problém, ktorý možno vyriešiť pomocou tohto plazmidu? Kde to môže byť potrebné a je to vôbec potrebné?

Cievna ateroskleróza je zúženie priesvitu tepien v dôsledku ukladania cholesterolu a iných látok, čo môže viesť k ischémii – zhoršenému prekrveniu orgánov a tkanív. Každý pozná ischemickú chorobu srdca - jednu z hlavných príčin smrti vo svete: ateroskleróza koronárnych artérií vedie k poškodeniu srdcového svalu, možné následky - angina pectoris alebo srdcový infarkt. Ale nechceli sme začať našu štúdiu s ischemickou chorobou srdca. Chirurgovia aktívne a celkom úspešne riešia tento problém, existuje veľa liečiv rôznych skupín, ktoré podporujú myokard. Samozrejme, o víťazstve nad infarktom sa zatiaľ netreba baviť, a predsa to nie je oblasť, kde nový liek budú prijaté s nadšením.

Začali sme uvažovať o tom, aké ďalšie ischemické choroby majú významný spoločenský význam a spomenuli sme si na pojem, ktorý pozná každý študent medicíny: „prerušovaná klaudikácia“ – príznak nedokrvenia ciev dolných končatín. Vazokonstrikcia nedovoľuje, aby krv prešla do svalov - pokožka nôh sa vysuší, nohy sa ochladia, po dlhej prechádzke začne bolesť v nohách, čo núti človeka zastaviť sa a odpočívať. Zdá sa, že to nie je strašidelné, ale tento problém nie je o nič menej významný ako ischémia myokardu. A možno ešte viac, pretože vývojári diagnostických nástrojov, farmaceutické spoločnosti a sociálne orgány jej venujú oveľa menšiu pozornosť. Medzitým je bolesť po dlhej prechádzke len začiatok. Ischémia bude nevyhnutne progredovať, bezbolestná vzdialenosť sa zníži z kilometra (čo sa už považuje za klinické štádium choroby) na 200 m alebo menej, potom začne bolesť v pokoji, potom ulcerózno-nekrotické zmeny tkaniva a v r. budúcnosť, amputácia v dôsledku gangrény.

Dnes lekári hovoria o pandémii aterosklerózy a táto pandémia neobišla ani Rusko. Rizikové faktory tohto ochorenia sú dobre známe: fajčenie a alkohol, nedostatok fyzickej aktivity, nevyvážená strava, stres. Riziko je vyššie u hypertonikov, ľudí s nadváhou s cukrovkou, u tých, ktorí majú zvýšenú hladinu cholesterolu a špeciálnych lipoproteínov v krvi. Existuje dedičná predispozícia k ateroskleróze: hovoria o nej, ak má pacient pokrvných príbuzných mužov, ktorí zomreli na infarkt alebo mozgovú príhodu pred dosiahnutím veku 55 rokov, a ženy pred dosiahnutím veku 65 rokov. Muži sú náchylnejší na skorý rozvoj aterosklerózy ako ženy a u všetkých sa riziko zvyšuje s vekom.

Chronická ischémia dolných končatín (CLLI) postihuje asi dvesto miliónov ľudí na celom svete. Existujú štatistiky o tejto chorobe v Spojených štátoch, v Európe a juhovýchodnej Ázii. Údaje za Rusko sú tiež dostupné, ale sú veľmi približné. Okrem problémov so zberom, spracovaním a šírením informácií sú tu aj objektívne ťažkosti. Napríklad infarkt myokardu sa vo všetkých štatistických výkazoch píše v samostatnom riadku, počítanie prípadov je jednoduché. Ale ako vziať do úvahy HINK? V počiatočných štádiách pacienti často nevyhľadávajú lekársku pomoc. Ak zoberieme do úvahy neskoré prípady, s nekrózami a amputáciami, nie vždy je možné oddeliť tie prípady, kde príčinou amputácie bola napríklad cukrovka alebo úraz. Vo všeobecnosti je táto sekcia štatistík dosť smutná. Odhaduje sa, že len v Spojených štátoch sa ročne vykoná okolo 150 000 amputácií. U nás je to podľa odborných lekárov od 45-tisíc do 150-tisíc ročne s prihliadnutím na stav zdravotníctva a kultúru starostlivosti o svoje zdravie.

Podľa približných údajov je v Rusku ročne diagnostikovaných asi 300 tisíc ľudí s chronickou ischémiou dolných končatín. Spravidla ide o ľudí vo veku 55 – 60 rokov a starších, existujú však aj skoré prípady. Veríme, že v krajine žije milión až dva milióny ľudí s týmto ochorením. Prognóza je pre nich nepriaznivá. Ak hovoríme o najťažších štádiách, treťom a štvrtom (bolesť v pokoji a nekróza), potom do jedného roka po diagnóze približne štvrtina z nich zomrie v dôsledku progresie aterosklerózy, a to aj v iných anatomických oblastiach; štvrtina prežije amputáciu, u štvrtiny postupuje poškodenie ciev nôh a len štvrtina moderná medicína môže dosiahnuť aspoň určitú stabilizáciu.

Ten istý plazmid

Čo môže takýmto ľuďom urobiť cievna chirurgia? Najjednoduchšou možnosťou je mechanická fixácia ciev: nahradenie problémovej oblasti protézou alebo vytvorenie cesty pre bypass prietoku krvi. Najprv však asi u štvrtiny pacientov anatomická štruktúra ciev je taká, že nie je možné vykonať chirurgickú rekonštrukciu. Po druhé, ateroskleróza nie vždy postihuje veľké cievy - môžu to byť aj tepny pod medzerou kolenného kĺbu, v dolnej časti nohy. Priemer ciev je tam malý a je veľká pravdepodobnosť, že chirurgický zákrok neprinesie želaný výsledok v dôsledku trombózy skratu, proliferácie endotelu a pod. Odborníci otvorene priznávajú, že cievna chirurgia nerieši všetky problémy v tejto oblasti.

Keď operácia zlyhá, lieky zostávajú. Ale ani farmakológia neponúka zázračný liek. Štandardná terapia pre takýchto pacientov zahŕňa vymenovanie liekov, ktoré zlepšujú reologické vlastnosti krvi a uvoľňujú tón cievnej steny. Keď sa ischémia stáva kritickou, prechádza z druhého štádia do tretieho a potom do štvrtého, pridávajú sa lieky skupiny prostaglandínov, ktoré rozširujú malé cievky. Krv tam „prepadne“, zlepší sa prekrvenie tkanív a predíde sa najhoršiemu. Ale každých šesť mesiacov sa táto terapia musí opakovať - ​​kým cievy nereagujú na prostaglandíny.

Okrem toho je Cilostazol registrovaný v Európe a Spojených štátoch. Hoci mechanizmus jeho účinku nie je úplne jasný, ukázalo sa, že zlepšuje periférny prietok krvi. Cilostazol sa odporúča na použitie v Európe a Spojených štátoch, ale máme zvláštnu situáciu: liek je uvedený v Národných usmerneniach pre liečbu pacientov s ochorením periférnych artérií, ale zatiaľ nebol schválený na použitie v Ruskej federácii. Okrem toho Európska lieková agentúra vydala v marci 2013 tlačovú správu, ktorá hovorila o vedľajších účinkoch cilostazolu spojených so srdcovou dysfunkciou. Teraz sa kontraindikáciou použitia považuje chronické srdcové zlyhanie. A to značne obmedzuje jeho použitie u pacientov s ischémiou dolných končatín: je medzi nimi veľa sŕdc, ateroskleróza je systémový jav.

Po zvážení tejto situácie sme sa rozhodli, že činnosť, ktorú vývojári predpokladali pre plazmidový konštrukt s génom VEGF, je angiogenéza, tvorba de novo cievy mikrovaskulatúry, - môžu byť užitočné. Prirodzene, nerobili sme domýšľavé vyhlásenia o víťazstve nad ischémiou. Náš liek nelieči aterosklerózu, ale obnovuje krvný obeh tam, kde je narušený, a umožňuje krvi dostať sa k bunkám a tkanivám ochudobneným o kyslík a živiny.

Lekárska komunita, ako som už spomínal, je dosť konzervatívna, najmä chirurgická. Pochopili sme, že za svoju správnosť budeme musieť bojovať. Neovasculgen bol zaregistrovaný v roku 2011 a odvtedy vedieme vysvetľujúce práce - cestujeme po krajine, organizujeme konferencie a sympóziá, komunikujeme s lekármi, hovoríme im o lieku a opravujeme niečo v našich nápadoch, berúc do úvahy to, čo sme sa naučili od nich. V zásade teraz začína to najzaujímavejšie. Sú za tým klinické štúdie, ktoré potvrdili bezpečnosť a účinnosť lieku pre významnú časť pacientov. Výsledky hovorili samy za seba (o nich trochu neskôr), pre odborníkov boli presvedčivé a názor odborníkov presvedčil úradníkov. Ukázalo sa, že angiogénna terapia ako nezávislý prvok komplexná liečba má právo na existenciu a začala sa delikátna, takmer klenotnícka práca - prispôsobenie lieku konkrétnym klinickým situáciám: bolo potrebné pochopiť, pre koho je indikovaný v prvom rade, keď sa má predpisovať v kombinácii s chirurgickou rekonštrukciou, s lieky z iných farmakologických skupín.

Dnes je vo svete schválených na klinické použitie len päť génových preparátov: tri na liečbu zhubných novotvarov, štvrtý na liečbu gliberu, na liečbu vzácnej dedičnej choroby – deficitu lipoproteínovej lipázy a náš neovaskulgen. Treba pochopiť, že génová terapia je iná. Liečba dedičných chorôb zahŕňa silnú dlhodobú korekciu porúch v genóme. Takto funguje glibera a iné podobné drogy, ktoré sa ešte nedostali na trh, no zrejme sa čoskoro objavia. Potrebujeme len dočasnú indukciu angiogenézy – náš genetický konštrukt funguje v bunkách od jedného dňa do 10-14 dní, spustí proces vaskulárneho rastu a potom zmizne. Samozrejme, nie je potrebné hovoriť o „zásahoch do genómu“.

To je dôvod, prečo sa liek podáva lokálne, v tých oblastiach, kde je potrebné pestovať nové cievy. V zahraničí sa pokúšali aplikovať podobné konštrukty intravenózne a intraarteriálne, ale nemalo to zmysel: pri kontakte s krvou liek rýchlo skolaboval. To je dobré, pretože to zaisťuje bezpečnosť: plazmid sa nemôže dostať do iných vzdialených častí tela a nespustí proces angiogenézy tam, kde je to nežiaduce.

Čo sa týka liekov na génovú terapiu na liečbu chronickej ischémie dolných končatín, zatiaľ je na trhu len neovaskulgén, no o chvíľu sa môžu objaviť ďalšie. Spoločnosť Sanofi-Aventis, ktorá sponzorovala klinické skúšky plazmidového konštruktu s génom pre fibroblastový rastový faktor, opustila preteky. Fibroblasty sa podieľajú na dozrievaní cievy – zhromažďujú sa okolo endotelového tubulu a vytvárajú pevnú stenu, ale to už nie je spustenie procesu, ale ďalšia fáza. Začať s posilňovaním fibroblastov bol riskantný nápad, ktorý nevyšiel. Vo svete však prebieha najmenej desiatka štúdií v tejto oblasti, niektoré z nich prešli z druhej do tretej fázy klinických skúšok. Japonskí vedci celkom úspešne dokončili štúdiu svojho lieku. Ide o plazmid podobný nášmu, no ako terapeutický faktor využíva gén pre rastový faktor hepatocytov HGF (hepatocyty sú pečeňové bunky, no v tomto prípade tento proteín napriek názvu stimuluje rast toho istého cievneho endotelu). V Japonsku úspešne dokončili tretiu fázu, ale nezačali liek registrovať, vyrábať a predávať, našli investície na organizáciu klinických skúšok v Spojených štátoch a namiesto malého domáceho trhu sa dostali na svet.

Ako to funguje

Účinnou látkou neovasculgenu je plazmid, to znamená molekula DNA uzavretá v kruhu. Vyrába sa biotechnologickou metódou: bunky Escherichia coli Escherichia coližijúci v bioreaktore mnohokrát kopírujú plazmid, potom sa izoluje a čistí. Plazmid obsahuje ľudský gén vegf, ktorý kóduje proteín - vaskulárny endotelový rastový faktor (VEGF - vascular endotelial growth factor; endotel je tu výstelka ciev, ich vnútorná vrstva). Tento proteín má niekoľko izoforiem, v tomto prípade sa používa VEGF165, ktorý pozostáva zo 165 aminokyselín. Ukázalo sa, že tento proteín najsilnejšie stimuluje delenie cievnych buniek.

Liečivo sa podáva pacientovi do boľavej nohy niekoľkými injekciami. Plazmid prenikne do buniek ischemického tkaniva, ktoré začnú syntetizovať proteín podľa plánu génu. Nie všetka DNA skončí vo vnútri buniek, ale nie je dôvod na obavy: životnosť tohto plazmidu v tele mimo bunky je desiatky minút, potom ho zničia enzýmy, takže sa genetický konštrukt nedostane do akýchkoľvek iných orgánov a tkanív, jeho pôsobenie bude len lokálne .

Bunky začnú syntetizovať a vylučovať VEGF165. Preniká do cievneho riečiska a viaže sa na receptory endotelových buniek. Toto je príkaz: "Začíname tu pestovať nové plavidlo." Bunky sa aktívne delia, migrujú smerom k ischemickému tkanivu a začínajú vytvárať nový cievny tubul, obtok krvi. Nie je to o nič menej komplikovaný proces ako výstavba novej cesty: je potrebné zorganizovať výjazd z hlavnej cesty, vyčistiť trasu, to znamená rozpustiť husté tkanivá v dráhe plavidla. Samozrejme, tubul, pozostávajúci z endotelových buniek, musí byť aj zvonka obalený svalovou vrstvou a vláknami. spojivové tkanivo. V dôsledku toho sa prietok krvi obnoví, tkanivá sú opäť plne zásobené kyslíkom a živinami – ischémia ustupuje.

výsledky

Náš liek prešiel všetkými štádiami klinických skúšok. V ruských regulačných dokumentoch sa nenazývajú „tri fázy“, ale význam sa od toho nemení: prvou fázou je hodnotenie bezpečnosti, druhou fázou je stanovenie dávkovacieho režimu, najbežnejšie vedľajšie účinky, prvá údaje o účinnosti a tretím je presné určenie účinnosti a zriedkavejšie vedľajšie účinky a komplikácie. Tri organizácie, v ktorých sa uskutočnili klinické skúšky, sú ruské vedecké centrum Chirurgia pomenovaná po B. V. Petrovskom, Štátna lekárska univerzita Ryazan a regionálna klinická nemocnica v Jaroslavli.

V prvej fáze sú zvyčajne priťahovaní zdraví mladí dobrovoľníci. V našom prípade by to však bolo neetické, keďže sme stále hovorili o génovej terapii. V tejto otázke sme mali plnú zhodu so zástupcami regulačného úradu (v tom čase, v roku 2009 to bola Federálna služba pre dohľad v zdravotníctve, teraz však funkcia registrácie liekov prešla priamo na ministerstvo zdravotníctva): zdravé ľuďom by sa nemal podávať génový konštrukt, je potrebné spojiť prvú fázu so začiatkom druhej a vykonať hodnotenie bezpečnosti už u pacientov. Na tomto rozhodnutí nebolo nič nezvyčajné: na celom svete sa silné lieky, aké sa používajú v psychiatrii, netestujú na zdravých dobrovoľníkoch.

Liečivo bolo testované v druhom a treťom stupni CINC podľa všeobecne uznávanej klasifikácie A. V. Pokrovského-Fonteina. Stupeň 2a - pacient môže prejsť asi kilometer a potom začne bolesť. Už v tomto štádiu dochádza k nezvratným zmenám v metabolizme svalových vlákien. Etapa 2b - bezbolestná vzdialenosť 200 metrov a menej a tretia etapa, keď sa už hovorí o kritickej ischémii dolných končatín - bolesť v pokoji, v sede a v ľahu. V tých istých štádiách je dnes indikované použitie neovaskulgénu – teda takmer vo všetkých, s výnimkou prvého, bezpríznakového, keď pacient ani nevie, že je chorý, a štvrtého, nekrotického, keď vredy a forma gangrény. Vyskytli sa však prípady, keď lekári predpisovali liek vo štvrtej fáze ako terapiu zúfalstva, pričom prižmúrili oči nad pokynmi. Pretože efekt prevýšil naše najoptimistickejšie predpoklady.

Lekári, ktorí sa zúčastnili na klinických skúškach, ich zvyčajne začínali s veľkou skepsou. Veľmi skúsený chirurg, ktorý videl desiatky, ak nie stovky ťažkých pacientov, dokonale reprezentujúcich všetky možnosti terapie a prognózy, je ponúknutý, aby pacientovi podal niekoľko inovatívnych injekcií – reakciu nie je ťažké si predstaviť. A potom prejdú dva týždne, zazvoní zvonček a lekár hovorí: „Môj pacient nechal barle a sám vyšiel na tretie poschodie.“ Takýto príbeh sa stal v Rostove na Done, kde testovali účinnosť lieku pod vedením doktora lekárskych vied, profesora Rostovskej štátnej lekárskej univerzity Ivana Ivanoviča Katelnitského. Teraz sme drogu zaregistrovali na Ukrajine, kde sa s ňou lekári stretli s nie menšou a možno ešte väčšou nedôverou ako ich ruskí kolegovia. Nedávno som od jedného z nich dostal e-mail s nadpisom: "Toto je bomba!" - tak bol ohromený výsledkom.

Hneď podotýkam, že zázračné príbehy sa, žiaľ, nestanú každému pacientovi. Ako pri každom lieku, existuje kategória pacientov, ktorí nereagujú na neovaskulgénnu terapiu. Snažíme sa zistiť, prečo sa to deje a čo sa tu dá opraviť. Okrem toho nie všetci pacienti trpia iba aterosklerózou: niekto ju má na pozadí cukrovky, alebo sa u niekoho vyvinie tromboangiitída (Buergerova choroba), a to samozrejme zhoršuje výsledok. Približne 15 % pacientov nereaguje na liečbu tak, ako by sme chceli – veľmi, veľmi málo. Existuje však jednoznačný pozitívny trend a dokonca možno konštatovať, že čím závažnejšia je ischémia, tým výraznejší je klinický efekt. S niektorými pacientmi sa stretávame už dva-tri roky. Kolegovia z Jaroslavľu (IN Staroverov, Ju. V. Červjakov) zhrnuli štatistiku za štyri roky – vidíme, že pacient, ktorý sotva prešiel 50 metrov, chodí za dva roky na dlhé prechádzky, vzdialenosť bez bolesti narástla na tri kilometre. V ranom štádiu sa vyskytol pozoruhodný prípad: pacient, vášnivý lovec, nebol po prvom kilometri spokojný s bolesťou nôh a liek si kúpil sám. Teraz tento muž loví losa a kráča mnoho kilometrov rýchlym tempom.

V rámci klinickej štúdie pacienti vypĺňali dotazníky na posúdenie zmien v kvalite života. Existovalo niekoľko škál, ktoré sa zúžili na dve zložky: fyzické zdravie a psychickú pohodu. Ukázalo sa, že fyzická zložka sa zlepšuje s veľmi dobrou spoľahlivosťou, je to vidieť na príklade rovnakej vzdialenosti bezbolestnej chôdze. Ale psychologické zlepšenia, aj keď boli zaznamenané, nedosiahli štatisticky významný rozdiel. Možno je fakt, že po dlhej prechádzke nohy predsa len začnú bolieť, ale ja chcem, aby ma neboleli vôbec, alebo možno len ťažko ľudia po ťažkej chorobe a pochmúrnych vyhliadkach veria v dobré veci, či ruskú mentalitu. , o ktorej sa toho toľko hovorí. Bolo by zaujímavé porovnať výsledky tohto ukazovateľa v iných krajinách.

Emisná cena

Koľko stojí liek, čo bude stáť liečba? Bohužiaľ, liek je drahý. V článku nemá zmysel uvádzať presné ceny, je ľahšie hľadať na internete, ale musíte sa naladiť na sumu asi sto tisíc rubľov za balík. Ak vezmeme do úvahy, že priebeh prostaglandínov stojí v priemere asi 40 tisíc rubľov a je potrebné ho opakovať každých šesť mesiacov a účinok neovaskulgenu pretrváva a dokonca sa zvyšuje najmenej dva až tri roky, potom to nie je také. pesimistický. Ale prečo je to vlastne také drahé?

Náš generálny riaditeľ, priamy nadriadený pre túto oblasť, AA Isaev, o tom hovorí: „Neovasculgen je prvý liek vo svojej triede, čo znamená veľké investície: roky výskumu, náročná práca s regulátormi a lekármi, obrovské úsilie na vytvorenie výroby na uvedenie na trh. A výstupom sú malé množstvá dávok drogy, kým sa jej používanie nestane rozšírenou praxou. Z toho vyplýva vysoká cena originálnych produktov v porovnaní s ich kópiami a takzvanými generikami. Cena, jedinečnosť a široké uplatnenie spolu úzko súvisia. Našou úlohou preto nie je len vyvinúť liek, ale aj sprístupniť ho všetkým. Usilovne na tom pracujeme.“

Z nášho pohľadu je želateľným vývojom zahrnutie neovasculgenu do zoznamu liekov, ktoré je možné zakúpiť na náklady federálneho alebo regionálneho rozpočtu a poskytnúť pacientom, ktorí takúto liečbu potrebujú. Takéto rozhodnutie je ekonomicky opodstatnené: napodiv, pacient s jednou nohou alebo bez nôh stojí štát za každú cenu viac ako nákup lieku, ktorý sa vyhne amputácii. Určitú nádej dáva aj fakt, že neovasculgen je oficiálne „inovačný liek“, teda je zaradený do príslušných zoznamov ako priorita a zasluhujúca si podporu štátu.

Je jasné, že náklady na neovaskulgen nemôžu byť veľmi nízke. pestovanie E. coli v bioreaktore, manipulácie s ním, izolácia a čistenie plazmidu, príprava lieková forma, kontrola kvality - to všetko je práca kvalifikovaného personálu, drahých prístrojov a činidiel. Ale je zaujímavé, že náklady len na výrobnú časť v Rusku sú asi osemkrát vyššie, ako keby sa to isté robilo povedzme v Izraeli. Dôvod je jednoduchý: zariadenia aj spotrebný materiál sa dovážajú, čo zvyšuje náklady. Okrem toho treba postupne vrátiť investície do klinických štúdií, do vzdelávania lekárov. Náš distribútor, spoločnosť Sotex, má svoje záujmy - je to jedna zo spoločností, ktoré sú súčasťou skupiny Protek, známej na farmaceutickom trhu. Nevyhnutná je aj ich práca, práve oni dodávajú drogu regiónom, aby bola dostupná viacerým obyvateľom metropoly.

Z našej strany vynakladáme maximálne úsilie na to, aby liek preukázal svoju účinnosť pri rozšírenom používaní – každý mesiac organizujeme terénne akcie, stretnutia, okrúhle stoly, komunikujeme s lekármi, odpovedáme na otázky. Pri pohľade na mapu Ruskej federácie už viem vymenovať špecialistov na cievnu chirurgiu v jednotlivých regiónoch. Nedá sa povedať, že by to bola prehliadka jednomyseľnosti - každý praktický lekár má svoje skúsenosti a svoj postoj k indikáciám a kontraindikáciám. Ale o droge vedia, používa sa, a to je pre nás hlavné. Keď sú výsledky a sú presvedčivé pre odbornú komunitu v konkrétnom regióne, je už jednoduchšie hovoriť s úradníkmi. Ak všetko pôjde dobre, čoskoro sa v arzenáli cievnych chirurgov objaví nový užitočný nástroj.

zdravie

Koncept nahradenia defektných génov zdravými, ktorá začala aktívne získavať vedecký škrupinku začiatkom deväťdesiatych rokov minulého storočia zdalo sa, že dáva nádej tým najbeznádejnejším pacientom. Od prvého experimentu s génovou terapiou, ktorý sa uskutočnil v roku 1990, sa však optimizmus medzi vedcami trochu zmenšil – a to všetko kvôli určitým zlyhaniam a ťažkostiam pri implementácii metód génovej terapie. Avšak možnosti, ktoré ponúka génová terapia na liečbu Parkinsonovej choroby, cystickej fibrózy, rôzne druhy rakovina a mnohé ďalšie choroby sú skutočne neobmedzené. Vedci preto neúnavne pracujú snažiace sa prekonať všetky ťažkosti, ktoré im vznikajú v ceste spojené s génovou terapiou.

Čo je génová terapia?

Čo je teda vlastne génová terapia? Na zodpovedanie tejto otázky je potrebné pripomenúť hlavnou funkciou génov v našom tele je regulácia tvorby bielkovín potrebné pre normálne fungovanie a zdravie všetkých buniek. Ale niektoré genetické defekty (defekty v génoch) zasahujú do ich hlavnej funkcie v tej či onej miere, bránia produkcii bielkovín. Cieľom génovej terapie (génovej terapie) je nahradenie defektných génov zdravými. To pomôže vytvoriť reprodukciu zodpovedajúceho proteínu, čo znamená, že osoba bude vyliečená z určitej choroby.

Ak vezmeme do úvahy ideálny scenár vývoja, bunky s upravené molekuly deoxyribonukleovej kyseliny (DNA) sa začne deliť, čím sa postupne vytvoria viaceré kópie opraveného génu, čo telu umožní zbaviť sa genetickej anomálie a úplne sa vyliečiť. Zavedenie zdravých génov do chorých buniek (ako aj pokusy o nápravu zodpovedajúcich odchýlok) je však mimoriadne zložitý proces, čo sa zatiaľ málokedy podarilo.. Preto je väčšina moderných výskumov zameraná na vývoj bezpečných a spoľahlivých mechanizmov na zavádzanie génov do poškodených buniek.

Typy génovej terapie: ex vivo a in vivo terapia

V závislosti od spôsobu zavedenia DNA do genómu pacienta sa môže uskutočniť génová terapia buď v bunkovej kultúre (ex vivo) alebo priamo v tele (in vivo). V prípade génovej terapie ex vivo sa bunky odoberú z tela pacienta, geneticky modifikujú a potom sa znovu zavedú späť do tela jedinca. Táto metóda je obzvlášť užitočná pri liečbe krvných porúch, pretože krvinky sa dajú celkom ľahko odstrániť a vrátiť späť. V prípade väčšiny iných chorôb však odstránenie buniek z tela a ich vloženie späť nie je ani zďaleka jednoduché. napr. v prípade srdcových chorôb z genetických príčin, účinným opatrením je takzvaná in vivo génová terapia, kedy sa génové zmeny uskutočňujú priamo v tele pacienta. Pri tomto postupe sa genetická informácia dostane priamo do bunky pomocou vektora - molekuly nukleovej kyseliny, používané v genetickom inžinierstve na prenos genetického materiálu. Vo väčšine prípadov používajú výskumníci na uskutočnenie tohto prenosu vírusy, ktoré nie sú zdraviu a životu nebezpečné.

Spôsoby prenosu genetickej informácie do bunky

Početné štúdie ukazujú, že použitie rôznych vírusov je veľmi efektívnym riešením, čo vám umožňuje dostať sa cez imunitnú obranu tela a potom infikovať bunky a použiť ich na šírenie vírusu. Na uskutočnenie tohto postupu genetickí inžinieri vybrali najvhodnejšie vírusy zo skupiny retrovírusov a adenovírusov. Retrovírusy prinášajú genetickú informáciu vo forme ribonukleovej kyseliny (RNA), molekuly podobnej DNA, ktorá pomáha spracovať genetickú informáciu uloženú v DNA. Len čo je možné preniknúť hlboko do takzvanej cieľovej bunky, z molekuly RNA sa získa kópia molekuly DNA. Tento proces sa nazýva reverzná transkripcia. Keď sa k bunke pripojí nová molekula DNA, všetky nové kópie bunky budú obsahovať tento modifikovaný gén.

Adenovírusy nesú genetickú informáciu okamžite vo forme DNA, ktorá je doručená do nedeliacej sa bunky. Hoci tieto vírusy dodávajú DNA priamo do jadra cieľovej bunky DNA nezapadá do genómu bunky. Takto upravený gén a genetická informácia neprechádzajú do dcérskych buniek. Výhodou génovej terapie realizovanej pomocou adenovírusov je, že je možné zaviesť gény do buniek nervového systému a do sliznice. dýchacieho traktu opäť pomocou vektora. Okrem toho existuje tretí spôsob génovej terapie, ktorý sa uskutočňuje prostredníctvom takzvaných adeno-asociovaných vírusov. Tieto vírusy obsahujú relatívne malé množstvo genetickej informácie a je oveľa ťažšie ich eliminovať ako retrovírusy a adenovírusy. Výhodou adeno-asociovaných vírusov je však to, že nevyvolávajú reakciu ľudského imunitného systému.

Ťažkosti pri použití vírusov v génovej terapii

Hlavným problémom spojeným so spôsobom prenosu genetickej informácie do bunky pomocou vírusov je ten je mimoriadne ťažké úplne kontrolovať spojenie génov s cieľovou bunkou. To môže byť mimoriadne nebezpečné, keďže nie je vylúčená ani takzvaná génová expresia, ktorá dokáže premeniť zdravé bunky na rakovinové. V tomto okamihu je tento problém obzvlášť dôležitý pri riešení retrovírusov. Druhý problém ktorých riešenie zatiaľ nie je možné zorganizovať, spočíva v tom, že jeden postup na použitie génovej terapie najčastejšie nestačí. Väčšinu genetických terapií je potrebné z času na čas opakovať. A po tretie, použitie vírusov na prenos genetickej informácie do bunky je komplikované rizikom reakcie imunitného systému tela. To je tiež mimoriadne vážny problém, najmä v prípadoch, keď keď je potrebné opakované opakovanie postupu génovej terapie, ako sa pacientovo telo postupne prispôsobuje a začína čoraz účinnejšie bojovať s vpichnutými vírusmi.

Génová terapia: Výskum pokračuje

Ak hovoríme o úspechu, tak v tomto momente je genetická terapia mimoriadne účinným opatrením. pri liečbe takzvanej kombinovanej imunodeficiencie, spojený s génom chromozómu X. Na druhej strane je veľmi málo prípadov úspešného využitia génovej terapie na liečbu tohto ochorenia. Navyše samotná liečba je riskantný podnik, pretože môže u pacientov spôsobiť množstvo symptómov, ktoré sa vyskytujú u ľudí trpiacich leukémiou. Okrem toho túto chorobu Existuje veľmi, veľmi málo prípadov použitia génovej terapie, ktorá by bola taká účinná, hoci nedávne štúdie dávajú nádej na skoré využitie génovej terapie na liečbu pacientov trpiacich artritídou, rakovinou mozgu, kosáčikovitou anémiou, rázštepom sietnice a niektorými ďalšími stavmi.

Ukazuje sa, že o praktické uplatnenie o génovej terapii v medicíne je ešte veľmi skoro hovoriť. napriek tomu výskumníci naďalej hľadajú spôsoby, ako bezpečne a efektívne využívať génovú terapiu, ktorý vykonal väčšinu experimentov so živým tkanivom preneseným z tela do umelého vonkajšieho prostredia. Spomedzi týchto experimentov sú mimoriadne zaujímavé štúdie, v ktorých sa vedci pokúšajú zaviesť do cieľovej bunky umelý, 47. chromozóm. Najnovšie vedecké poznatky umožnili vedcom lepšie pochopiť procesy vyskytujúce sa počas zavádzania molekuly RNA. To viedlo k vývoju mechanizmu na potlačenie transkripcie génu (tzv. génový knockout), ktorý môže byť prínosom pri liečbe Hamiltonovej choroby. Vedci tiež uvádzajú, že sa im podarilo vyvinúť spôsob prenosu genetických informácií do mozgových buniek, čo predtým nebolo možné pomocou vektora, pretože táto molekula bola na tento účel príliš veľká. Inými slovami, výskum pokračuje, čo znamená, že ľudstvo má všetky šance naučiť sa bojovať s chorobami pomocou metód génovej terapie.

Úvod

Každý rok vo vedeckých časopisoch pribúdajú články o medicíne klinický výskum, pri ktorej sa tak či onak využívala liečba založená na zavádzaní rôznych génov – génová terapia. Tento smer vyrástol z tak dobre rozvinutých odvetví biológie, ako je molekulárna genetika a biotechnológia.

Často, keď už boli vyskúšané konvenčné (konzervatívne) metódy, je to práve génová terapia, ktorá môže pacientom pomôcť prežiť a dokonca sa úplne zotaviť. Týka sa to napríklad dedičných monogénnych chorôb, teda chorôb spôsobených defektom jedného génu, ako aj mnohých iných. Alebo napríklad génová terapia môže pomôcť a zachrániť končatinu tým pacientom, ktorí majú zúžený cievny lúmen dolných končatín a v dôsledku toho sa vyvinula pretrvávajúca ischémia okolitých tkanív, to znamená, že tieto tkanivá sú vážne deficitné živiny a kyslík, ktoré sú normálne prenášané krvou po celom tele. Často je nemožné liečiť takýchto pacientov chirurgickými manipuláciami a liekmi, ale ak sú bunky lokálne nútené vylučovať viac proteínových faktorov, ktoré by ovplyvnili proces tvorby a klíčenia nových ciev, potom by sa ischémia stala oveľa menej výraznou a stala by sa pre pacientov oveľa jednoduchšie žiť.

génová terapia dnes možno definovať ako liečbu chorôb zavádzaním génov do buniek pacientov s cieľom zamerať sa na génové defekty alebo dať bunkám nové funkcie. Prvé klinické skúšky metód génovej terapie sa uskutočnili až 22. mája 1989 s cieľom diagnostikovať rakovinu. Prvým dedičným ochorením, pri ktorom sa aplikovali metódy génovej terapie, bola dedičná imunodeficiencia.

Každoročne narastá počet úspešne vykonaných klinických štúdií na liečbu rôznych ochorení pomocou génovej terapie a do januára 2014 dosiahol 2 tis.

V modernom výskume génovej terapie je zároveň potrebné vziať do úvahy, že dôsledky manipulácie s génmi či „premiešanej“ (rekombinantnej) DNA in vivo(lat. doslova "živý") neboli dostatočne preštudované. V krajinách s najpokročilejšou úrovňou výskumu v tejto oblasti, najmä v USA, lekárske protokoly využívajúce sekvencie sense DNA podliehajú povinnému skúmaniu v príslušných výboroch a komisiách. V USA sú to Poradný výbor pre rekombinantnú DNA (RAC) a Food and Drug Administration (FDA) s následným povinným schválením projektu riaditeľom National Institutes of Health (National Institutes of Health).

Preto sme sa rozhodli, že táto liečba je založená na skutočnosti, že ak niektorým tkanivám tela chýbajú niektoré individuálne proteínové faktory, potom sa to dá napraviť zavedením vhodných génov kódujúcich proteíny do týchto tkanív a všetko bude viac-menej úžasné. . Samotné bielkoviny nie je možné aplikovať injekčne, pretože naše telo okamžite zareaguje neslabou imunitnou odpoveďou a dĺžka pôsobenia by bola nedostatočná. Teraz sa musíme rozhodnúť o spôsobe dodania génu do buniek.

Transfekcia bunky

Na začiatok je vhodné uviesť definície niektorých pojmov.

Prenos génov sa uskutočňuje pomocou vektor je molekula DNA používaná ako „nosič“ na umelý prenos genetickej informácie do bunky. Existuje mnoho typov vektorov: plazmidové, vírusové, ako aj kozmidy, fazmidy, umelé chromozómy atď. Je zásadne dôležité, aby vektory (najmä plazmidové vektory) mali svoje charakteristické vlastnosti:

1. Pôvod replikácie (ori)- nukleotidová sekvencia, v ktorej začína duplikácia DNA. Ak sa nepodarí zdvojiť (replikovať) vektorovú DNA, potom sa nedosiahne potrebný terapeutický efekt, pretože sa jednoducho rýchlo rozštiepi intracelulárnymi nukleázovými enzýmami a v dôsledku nedostatku templátov sa nakoniec vytvorí oveľa menej molekúl proteínov. Treba poznamenať, že tieto body sú špecifické pre každý biologický druh, to znamená, že ak sa má vektorová DNA získať jej reprodukciou v bakteriálnej kultúre (a nielen chemickou syntézou, ktorá je zvyčajne oveľa drahšia), potom dve body začiatku replikácie sa budú vyžadovať samostatne - pre ľudí a pre baktérie;

2. Reštrikčné stránky- špecifické krátke sekvencie (zvyčajne palindromické), ktoré sú rozpoznávané špeciálnymi enzýmami (reštrikčné endonukleázy) a sú nimi určitým spôsobom strihané - s tvorbou "lepivých koncov" (obr. 1).

Obr.1 Tvorba "lepivých koncov" za účasti restriktáz

Tieto miesta sú nevyhnutné na zosieťovanie vektorovej DNA (ktorá je v skutočnosti "prázdna") s požadovanými terapeutickými génmi do jedinej molekuly. Takáto molekula zosieťovaná z dvoch alebo viacerých častí sa nazýva "rekombinantná";

3. Je jasné, že by sme chceli získať milióny kópií molekuly rekombinantnej DNA. Opäť, ak máme čo do činenia s kultúrou bakteriálnych buniek, tak táto DNA musí byť ďalej izolovaná. Problém je v tom, že nie všetky baktérie prehltnú molekulu, ktorú potrebujeme, niektoré nie. Aby sa tieto dve skupiny rozlíšili, vkladajú sa do vektorovej DNA selektívne markery- oblasti odolnosti voči určitým chemikáliám; Teraz, ak sa tieto isté látky pridajú do životného prostredia, prežijú iba tie, ktoré sú voči nim odolné, a zvyšok zomrie.

Všetky tieto tri zložky možno pozorovať v úplne prvom umelo syntetizovanom plazmide (obr. 2).

Obr.2

Samotný proces zavádzania plazmidového vektora do určitých buniek je tzv transfekcia. Plazmid je pomerne krátka a zvyčajne kruhová molekula DNA, ktorá sa nachádza v cytoplazme bakteriálnej bunky. Plazmidy nie sú spojené s bakteriálnym chromozómom, môžu sa replikovať nezávisle od neho, môžu byť uvoľnené baktériou do prostredia alebo naopak absorbované (proces absorpcie je transformácia). Pomocou plazmidov si baktérie môžu vymieňať genetické informácie, napríklad prenášať rezistenciu na niektoré antibiotiká.

Plazmidy existujú v baktériách in vivo. Ale nikto nemôže zabrániť výskumníkovi, aby umelo syntetizoval plazmid, ktorý bude mať vlastnosti, ktoré potrebuje, všil doň inzertný gén a zaviedol ho do bunky. Do rovnakého plazmidu môžu byť vložené rôzne inzerty .

Metódy génovej terapie

Existujú dva hlavné prístupy, ktoré sa líšia povahou cieľových buniek:

1. fetálny, pri ktorom je cudzia DNA zavedená do zygoty (oplodneného vajíčka) alebo embrya v ranom štádiu vývoja; v tomto prípade sa očakáva, že zavedený materiál vstúpi do všetkých buniek príjemcu (a dokonca aj do zárodočných buniek, čím sa zabezpečí prenos do ďalšej generácie). U nás je to vlastne zakázané;

2. Somatické, pri ktorých sa genetický materiál vnáša do nepohlavných buniek už narodených a neprenáša sa do zárodočných buniek.

Génová terapia in vivo je založená na priamom zavedení klonovaných (namnožených) a špecificky zabalených sekvencií DNA do určitých tkanív pacienta. Obzvlášť sľubné na liečbu génových chorôb in vivo je zavedenie génov pomocou aerosólových alebo injekčných vakcín. Aerosólová génová terapia sa spravidla vyvíja na liečbu pľúcnych ochorení (cystická fibróza, rakovina pľúc).

Vývoju programu génovej terapie predchádza mnoho etáp. To zahŕňa dôkladnú analýzu tkanivovo špecifickej expresie zodpovedajúceho génu (tj syntézu na génovej matrici nejakého proteínu v určitom tkanive) a identifikáciu primárneho biochemického defektu a štúdium štruktúry, funkcie a intracelulárnu distribúciu svojho proteínového produktu, ako aj biochemická analýza patologický proces. Všetky tieto údaje sa berú do úvahy pri zostavovaní príslušného lekárskeho protokolu.

Pri zostavovaní schém génovej korekcie je dôležité, aby sa účinnosť transfekcie, stupeň korekcie primárneho biochemického defektu v podmienkach bunkovej kultúry ( in vitro,"in vitro") a čo je najdôležitejšie, in vivo na zvieracích biologických modeloch. Až potom môže začať program klinického skúšania. .

Priame dodávanie a bunkové nosiče terapeutických génov

Existuje mnoho metód na zavedenie cudzej DNA do eukaryotickej bunky: niektoré sa spoliehajú na fyzikálne spracovanie (elektroporácia, magnetofekcia atď.), iné na použitie chemických materiálov alebo biologických častíc (napr. vírusy), ktoré sa používajú ako nosiče. Hneď stojí za zmienku, že chemické a fyzikálne metódy sa zvyčajne kombinujú (napríklad elektroporácia + obalenie DNA lipozómami)

Priame metódy

1. Chemickú transfekciu možno klasifikovať do niekoľkých typov: s použitím cyklodextrínovej substancie, polymérov, lipozómov alebo nanočastíc (s chemickou alebo vírusovou funkcionalizáciou, t. j. povrchovou modifikáciou alebo bez nej).
a) Jednou z najlacnejších metód je použitie fosforečnanu vápenatého. Zvyšuje účinnosť inkorporácie DNA do buniek 10-100 krát. DNA tvorí s vápnikom silný komplex, ktorý zabezpečuje jeho efektívne vstrebávanie. Nevýhodou je, že do jadra sa dostane len asi 1 - 10 % DNA. Použitá metóda in vitro na prenos DNA do ľudských buniek (obr. 3);

Obr.3

b) Využitie vysoko rozvetvených organických molekúl – dendriméru, na naviazanie DNA a jej prenos do bunky (obr. 4);

Obr.4

c) Veľmi účinnou metódou transfekcie DNA je jej zavedenie prostredníctvom lipozómov – malých, membránou obklopených teliesok, ktoré sa dokážu spojiť s bunkovou cytoplazmatickou membránou (CPM), čo je dvojitá vrstva lipidov. Pre eukaryotické bunky je transfekcia účinnejšia s katiónovými lipozómami, pretože bunky sú na ne citlivejšie. Proces má svoj vlastný názov - lipofekcia. Táto metóda je dnes považovaná za jednu z najbezpečnejších. Lipozómy sú netoxické a neimunogénne. Účinnosť prenosu génov pomocou lipozómov je však obmedzená, pretože nimi zavedená DNA do buniek je zvyčajne okamžite zachytená lyzozómami a zničená. Vnášanie DNA do ľudských buniek pomocou lipozómov je dnes základom terapie. in vivo(obr. 5);

Obr.5

d) Ďalším spôsobom je použitie katiónových polymérov, ako je dietylaminoetyldextrán alebo polyetylénimín. Negatívne nabité molekuly DNA sa viažu na pozitívne nabité polykatióny a tento komplex sa potom dostáva do bunky endocytózou. DEAE-dextrán mení fyzikálne vlastnosti plazmatickej membrány a stimuluje príjem tohto komplexu bunkou. Hlavnou nevýhodou metódy je, že DEAE-dextrán je vo vysokých koncentráciách toxický. Metóda nebola rozšírená v génovej terapii;

e) Pomocou histónov a iných jadrových proteínov. Tieto proteíny, obsahujúce veľa kladne nabitých aminokyselín (Lys, Arg), v prirodzených podmienkach pomáhajú kompaktne zbaliť dlhý reťazec DNA do relatívne malého bunkového jadra.

2. Fyzikálne metódy:

a) Elektroporácia je veľmi populárna metóda; okamžité zvýšenie priepustnosti membrány sa dosiahne v dôsledku skutočnosti, že bunky sú krátkodobo vystavené intenzívnemu elektrickému poľu. Ukázalo sa, že za optimálnych podmienok môže počet transformantov dosiahnuť 80 % prežívajúcich buniek. V súčasnosti sa na ľuďoch nepoužíva (obr. 6).

Obr.6

b) „Stláčanie buniek“ – metóda vynájdená v roku 2013. Umožňuje dodávať molekuly bunkám „mäkkým stláčaním“ bunkovej membrány. Metóda eliminuje možnosť toxicity alebo nesprávneho zásahu do cieľa, pretože nezávisí od vonkajších materiálov alebo elektrických polí;

c) Sonoporácia - metóda umelého prenosu cudzej DNA do buniek ich vystavením ultrazvuku, čo spôsobí otvorenie pórov v bunkovej membráne;
d) Optická transfekcia – metóda, pri ktorej sa v membráne vytvorí malý otvor (priemer približne 1 µm) pomocou vysoko zaostreného lasera;
e) Hydrodynamická transfekcia – metóda na dodávanie genetických konštruktov, proteínov atď. riadeným zvýšením tlaku v kapilárach a intersticiálnej tekutine, čo spôsobí krátkodobé zvýšenie priepustnosti bunkových membrán a tvorbu dočasných pórov v nich. Vykonáva sa rýchlou injekciou do tkaniva, pričom podávanie je nešpecifické. Účinnosť podávania pre kostrové svalstvo – 22 až 60 % ;

f) DNA mikroinjekcia - zavedenie do jadra živočíšnych buniek pomocou tenkých sklenených mikrotubulov (d=0,1-0,5 µm). Nevýhodou je zložitosť metódy, vysoká pravdepodobnosť deštrukcie jadra alebo DNA; môže byť transformovaný obmedzený počet buniek. Nepoužíva sa pre ľudí.

3. Metódy založené na časticiach.

a) Priamym prístupom k transfekcii je génová pištoľ, v ktorej sa DNA spája do nanočastice s inertnými pevnými látkami (zvyčajne zlatom, volfrámom), ktoré potom „vystrelia“ nasmerované na jadrá cieľových buniek. Táto metóda sa aplikuje in vitro A in vivo na zavedenie génov, najmä do buniek svalového tkaniva, napríklad pri chorobe, ako je Duchennova myodystrofia. Veľkosť častíc zlata je 1-3 mikróny (obr. 7).

Obr.7

b) Magnetofekcia – metóda, ktorá využíva sily magnetizmu na dodanie DNA do cieľových buniek. Najprv sú nukleové kyseliny (NA) spojené s magnetickými nanočasticami a potom pôsobením magnetického poľa sú častice vháňané do bunky. Účinnosť je takmer 100%, je zaznamenaná zjavná netoxicita. Už po 10-15 minútach sú častice zaregistrované v bunke - je to oveľa rýchlejšie ako iné metódy.
c) Napichovanie (napichovanie; „napichovanie“, dosl. „napichovanie“ + „infekcia“) – spôsob dodávania využívajúci nanomateriály, ako sú uhlíkové nanorúrky a nanovlákna. V tomto prípade sú bunky doslova prepichnuté podložkou z nanofibríl. Predpona „nano“ sa používa na označenie ich veľmi malých rozmerov (v miliardtinách metra) (obr. 8).

Obr.8

Samostatne stojí za to zdôrazniť takú metódu, ako je transfekcia RNA: do bunky sa nedodáva DNA, ale molekuly RNA - ich „nástupcovia“ v reťazci biosyntézy proteínov; zároveň sa aktivujú špeciálne proteíny, ktoré štiepia RNA na krátke fragmenty – tzv. malá interferujúca RNA (siRNA). Tieto fragmenty sa viažu na iné proteíny a v konečnom dôsledku to vedie k inhibícii expresie zodpovedajúcich génov bunkou. Je tak možné zablokovať pôsobenie tých génov v bunke, ktoré v súčasnosti potenciálne spôsobujú viac škody ako úžitku. Transfekcia RNA našla široké uplatnenie najmä v onkológii.

Uvažuje sa o základných princípoch prenosu génov pomocou plazmidových vektorov. Teraz môžeme prejsť k úvahám o vírusových metódach. Vírusy sú nebunkové formy života, najčastejšie ide o molekulu nukleovej kyseliny (DNA alebo RNA) obalenú proteínovým obalom. Ak z genetického materiálu vírusu vystrihneme všetky tie sekvencie, ktoré spôsobujú výskyt chorôb, potom sa aj celý vírus môže úspešne zmeniť na „vozidlo“ pre náš gén.

Proces zavádzania DNA do bunky, sprostredkovaný vírusom, sa nazýva tzv transdukcia.
V praxi sa najčastejšie používajú retrovírusy, adenovírusy a adeno-asociované vírusy (AAV). Na začiatok stojí za to zistiť, čo by malo byť ideálnym kandidátom na transdukciu medzi vírusmi. Kritériá sú, že musí byť:

stabilný;
. kapacita, to znamená, že obsahuje dostatočné množstvo DNA;
. inertný vo vzťahu k metabolickým dráham bunky;
. presný – ideálne by mal integrovať svoj genóm do špecifického lokusu genómu jadra hostiteľa atď.

V reálnom živote je veľmi ťažké skombinovať aspoň niekoľko bodov, takže väčšinou k voľbe dochádza pri posudzovaní každého jednotlivého prípadu samostatne (obr. 9).

Obr.9

Z uvedených troch najpoužívanejších vírusov je AAV najbezpečnejší a zároveň najpresnejší. Takmer jedinou ich nevýhodou je relatívne malá kapacita (okolo 4800 bp), ktorá sa však ukazuje ako dostatočná pre mnohé gény .

Okrem vyššie uvedených metód sa génová terapia často používa v kombinácii s bunkovou terapiou: najprv sa kultúra určitých ľudských buniek zasadí do živného média, potom sa potrebné gény tak či onak zavedú do buniek, kultivujú sa a znova sa transplantovali do hostiteľského organizmu. Výsledkom je, že bunky sa môžu vrátiť k svojim normálnym vlastnostiam. Takže napríklad ľudské biele krvinky (leukocyty) boli modifikované pri leukémii (obr. 10).

Obr.10

Osud génu po vstupe do bunky

Keďže pri vírusových vektoroch je vďaka ich schopnosti efektívnejšie dopravovať gény do konečného cieľa – jadra, všetko viac-menej jasné, pozastavíme sa nad osudom plazmidového vektora.

V tomto štádiu sme dosiahli, že DNA prešla prvou veľkou bariérou – cytoplazmatickou membránou bunky.

Ďalej, v kombinácii s inými látkami, s obalom alebo bez obalu, sa musí dostať do bunkového jadra, aby špeciálny enzým - RNA polymeráza - syntetizoval molekulu messenger RNA (mRNA) na šablóne DNA (tento proces sa nazýva prepis). Až potom sa mRNA dostane do cytoplazmy, vytvorí komplex s ribozómami a podľa genetického kódu sa syntetizuje polypeptid - napríklad vaskulárny rastový faktor (VEGF), ktorý začne vykonávať určitú terapeutickú funkciu ( v tomto prípade naštartuje tvorbu cievneho vetvenia v tkanive náchylnom na ischémiu) .

Čo sa týka expresie zavedených génov v požadovanom bunkovom type, tento problém sa rieši pomocou transkripčných regulačných prvkov. Tkanivo, v ktorom dochádza k expresii, je často určené kombináciou tkanivovo špecifického zosilňovača („zosilňovacia“ sekvencia) s konkrétnym promótorom (nukleotidová sekvencia, z ktorej začína syntéza RNA polymerázy), ktorý môže byť indukovateľný. . Je známe, že génová aktivita môže byť modulovaná in vivo vonkajšie signály, a keďže zosilňovače môžu pracovať s akýmkoľvek génom, do vektorov sa môžu zaviesť aj izolátory, ktoré pomáhajú zosilňovaču pracovať bez ohľadu na jeho polohu a môžu sa správať ako funkčné bariéry medzi génmi. Každý zosilňovač obsahuje súbor väzbových miest na aktiváciu alebo potlačenie proteínových faktorov. Promótory môžu tiež regulovať hladinu génovej expresie. Napríklad existujú metalotioneín alebo promótory citlivé na teplotu; hormónmi riadené promótory.

Expresia génu závisí od jeho polohy v genóme. Vo väčšine prípadov existujúce vírusové metódy vedú len k náhodnému vloženiu génu do genómu. Aby sa eliminovala takáto závislosť, pri konštrukcii vektorov je gén vybavený známymi nukleotidovými sekvenciami, ktoré umožňujú expresiu génu bez ohľadu na miesto jeho inzercie do genómu.

Najjednoduchším spôsobom regulácie expresie transgénu je poskytnúť mu indikátorový promótor, ktorý je citlivý na fyziologický signál, ako je uvoľňovanie glukózy alebo hypoxia. Takéto "endogénne" kontrolné systémy môžu byť užitočné v niektorých situáciách, ako je kontrola produkcie inzulínu závislá od glukózy. Spoľahlivejšie a všestrannejšie sú „exogénne“ kontrolné systémy, keď je expresia génu riadená farmakologicky zavedením malej molekuly liečiva. V súčasnosti sú známe 4 hlavné kontrolné systémy – regulované tetracyklínom (Tet), hmyzím steroidom, ekdyzónom alebo jeho analógmi, antiprogestínovým liekom maifpriston (RU486) a chemickými dimerizátormi, ako je rapamycín a jeho analógy. Všetky zahŕňajú na liečivo závislý nábor transkripčnej aktivačnej domény do hlavného promótora, ktorý vedie požadovaný gén, ale líšia sa v mechanizmoch tohto náboru. .

Záver

Preskúmanie údajov vedie k záveru, že napriek úsiliu mnohých laboratórií vo svete sú všetky už známe a testované in vivo A in vitro vektorové systémy nie sú ani zďaleka dokonalé . Ak je problém cudzieho dodania DNA in vitro prakticky vyriešený a jeho dodanie do cieľových buniek rôznych tkanív in vivoúspešne vyriešené (hlavne vytvorením konštruktov, ktoré nesú receptorové proteíny, vrátane antigénov špecifických pre určité tkanivá), potom ďalšie charakteristiky existujúcich vektorových systémov - integračná stabilita, regulovaná expresia, bezpečnosť - stále potrebujú vážne vylepšenia.

V prvom rade ide o stabilitu integrácie. Doteraz bola integrácia do genómu dosiahnutá iba použitím retrovírusových alebo adeno-asociovaných vektorov. Účinnosť stabilnej integrácie možno zvýšiť zlepšením génových konštruktov, ako sú systémy sprostredkované receptormi, alebo vytvorením dostatočne stabilných epizomálnych vektorov (t. j. štruktúr DNA schopných dlhodobého pobytu vo vnútri jadier). V poslednej dobe sa osobitná pozornosť venuje vytváraniu vektorov založených na umelých chromozómoch cicavcov. Vďaka prítomnosti základných štrukturálnych prvkov obyčajných chromozómov sú takéto minichromozómy zadržané v bunkách po dlhú dobu a sú schopné niesť gény plnej veľkosti (genómové) a ich prirodzené regulačné prvky, ktoré sú potrebné pre správne fungovanie. génu, v správnom tkanive a v správnom čase.

Génová a bunková terapia otvára skvelé vyhliadky na obnovu stratených buniek a tkanív a genetický inžiniersky dizajn orgánov, čo nepochybne výrazne rozšíri arzenál metód pre biomedicínsky výskum a vytvorí nové možnosti na zachovanie a predĺženie ľudského života.